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http://hdl.handle.net/10773/29433
Título: | MS analytical strategies for identifying nitroxidative modifications in phospholipids |
Outros títulos: | Identificação de modificações nitroxidativas em fosfolípidos utilizando espectrometria de massa |
Autor: | Bullon, Javier Fernando Montero |
Orientador: | Domingues, Pedro Domingues, Maria do Rosário |
Palavras-chave: | RNS Nitroxidative stress Nitrated fatty acids NO2FA Nitroxidation Nitroxidized phospholipids Lipidomic LC-MS MS/MS Cardiolipin Nitro-phospholipid Adducts Post-translational modification Nitroalkylation Lipoxidation Phospholipidome Lipid profile High-throughput analysis Myocardial infarction Cachexia Exercise |
Data de Defesa: | Jul-2019 |
Resumo: | Nitroxidized lipids are recognized as important bioactive molecules in
physiological and pathophysiological conditions. They are generated in vivo by
the reaction of lipids with reactive nitrogen species (RNS) under nitroxidative
stress conditions. Nitrated fatty acids (NO2FAs) are the most studied nitroxidized
lipids. NO2FAs were well-characterized in vitro and detected in vivo, in tissues
and biofluids. They are associated with relevant biological roles, such as
mediating anti-inflammatory, antioxidant, vasculoprotective, anti-hyperglycemic,
antitumoral and cytoprotective activities. One of the main mechanisms for these
activities is the covalent interaction of NO2FAs with proteins. Nitroxidized
phospholipids were recently identified in vivo, namely in phosphatidylcholines
and phosphatidylethanolamines. However, this subject remains largely
unaddressed, although the first studies indicate that nitroxidized phospholipids
also own significant biological activity. Moreover, the ability of nitroxidized
phospholipids to form covalent adducts with peptides or proteins is not yet
reported.
Thus, the main goal of the work developed in this PhD thesis has been to
contribute for the advancement of mass spectrometry (MS)-based analysis of
nitroxidized phospholipids and their covalent adducts with proteins, by using in
vitro models for the generation of new species. Also, the impact of nitroxidative
stress in vivo lipidome has was studied by using liquid chromatography (LC)-MS
and tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis. The data obtained using
these approaches were then correlated with the studied pathological conditions,
i.e., acute myocardial infarction and cancer-induced cachexia.
In this work, state-of-the-art LC-MS and MS/MS platforms were used analysing
nitroxidized phospholipids. In vitro assays were used to characterize for the first
time nitroxidized species of cardiolipin, and adducts between nitro-phospholipids
and peptides representing potential targets in proteins. Up to ten different
nitroxidative modifications were identified for cardiolipin by LC-MS and MS/MS,
by using their chromatographic behaviour, exact mass measurements and
MS/MS fragmentation pathways. Adduction between nitro-phospholipids and
glutathione was demonstrated, as confirmed by MS/MS analysis of the adducts
using different MS instruments. Analysis of biological samples where
nitroxidative stress was expected to occur, namely myocardial infarction and
cachexia, was performed by HILIC-LC-MS and MS/MS lipidomics. These studies
revealed a strong impact in the lipidic phenotype that allowed to classify between
health and disease status. It also allowed to point out molecular species
responsive to onset and progress of the disease, as PUFA-containing
phospholipids, plasmalogens, and cardiolipins in myocardial infarction, or
cardiolipins and phosphatidylserines in cachexia.In conclusion, these results contribute to the study of the effect of nitroxidative
stress in the lipidome in different ways. They provide a database and protocols
for implementation of in vivo detection of new nitroxidized phospholipids and their
adducts with proteins. The profiling of the lipidome in biological samples under
nitroxidative stress constitutes a reference to undertaking the challenge of
detecting nitroxidized phospholipid in vivo and provided a perspective of the
changes occurring in lipidome in clinical situations related to nitroxidative stress.
These results are also useful to direct future investigation and contribute for the
discussion on the clinical relevance of the modulation of the lipidome in health
and disease. Overall, this work provides a step forward in the MS-based analysis
and understanding of the effect of nitroxidative stress in lipids and the lipidome,
and its potential biological significance, diagnostic value and therapeutic utility. Os lípidos nitroxidados são moléculas bioativas que desempenham funções importantes em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Estes lípidos nitroxidados são formados in vivo pela reação de lípidos com espécies reativas de nitrogénio (RNS), em condições de stress nitroxidativo. Os ácidos gordos nitrados (NO2FAs) são os lipídos nitroxidados mais estudados. Os NO2FAs já foram caracterizados in vitro, e têm sido detetados in vivo, em tecidos e biofluidos. Estas moléculas têm sido associadas a funções biológicas relevantes, mediando atividades anti-inflamatórias, antioxidantes, vasculoprotetoras, anti-hiperglicémicas, antitumorais e citoprotetoras. Um dos principais mecanismos relacionados com estas atividades é a interação covalente dos NO2FAs com proteínas. Os fosfolípidos nitroxidados foram recentemente identificados in vivo, nomeadamente as fosfatidilcolinas e as fosfatidiletanolaminas. No entanto, este campo de investigação permanece pouco explorado, apesar de os primeiros estudos indicarem que os fosfolipídos nitroxidados também possuem atividade biológica significativa. Além disso, a capacidade dos fosfolipídos nitroxidados formarem aductos covalentes com peptídeos ou proteínas ainda não foi reportada. Assim, o principal objetivo do trabalho desenvolvido nesta tese de doutoramento foi o desenvolvimento da análise de fosfolipídos nitroxidados e seus aductos covalentes com proteínas utilizando a espectrometria de massa (MS) e modelos in vitro para a geração de novas espécies. Além disso, foi estudado o impacto do stress nitroxidativo in vivo no lipidoma por análise cromatografia liquída associada à MS (LC-MS) e e espectrometria de massa tandem (MS/MS). Os resultados foram correlacionados com condições patológicas em estdo,i.e., o enfarte agudo do miocárdio e a caquexia induzida por cancro. Assim, neste trabalho, foram utilizadas plataformas de LC-MS e MS/MS de última geração para a análise de fosfolipídos nitroxidados. Foram desenvolvidos ensaios in vitro para caracterizar, pela primeira vez, espécies de cardiolipina nitroxidada bem como aductos entre nitro-fosfolipídos e péptidos representando potenciais alvos em proteínas. Foram identificadas dez modificações nitroxidativas diferentes para a cardiolipina, utilizando a LC-MS e MS/MS utilizando diversos critérios tais como o seu comportamento cromatográfico, medições exatas de massa e as vias de fragmentação em MS/MS. A adição entre nitro-fosfolipídios e a glutationa foi demonstrada, como confirmado pela análise MS/MS dos aductos usando diferentes espectrómetros de massa. O estudo de amostras biológicas ondeé esperada a presença de stress nitroxidativo, nomeadamente, enfarte do miocárdio e caquexia, foi realizado através da análise lipidómica com LC-MS e MS/MS. Esses estudos revelaram um forte impacto do stress nitroxidativo no fenótipo lipídico, que permitiu a diferenciação entre o estado saudável e patológico. Também foi possívelidentificar espécies moleculares que respondem ao início e progressão da doença, como os fosfolipídos contendo ácidos gordos poliinsaturados, plasmalogénios e cardiolipinas em caso de enfarte do miocárdio, ou as cardiolipinas e fosfatidilserinas na caquexia. Em conclusão, estes resultados contribuem para o desenvolvimento da estudo do efeito do stress nitroxidativo no lipidoma em diversas condiçoes fisiológicas e patológicas e constituem um banco de dados e protocolos para a implementação da deteção in vivo de novos fosfolipídios nitroxidados e seus adutos com proteínas. Adicionalmente, a caracterização do lipidoma em amostras biológicas sob stress nitroxidativo supõe uma referência para detetar fosfolípidos nitroxidizados in vivo e fornece uma perspetiva das mudanças que ocorrem no lipidoma, em situações clínicas relacionadas com o stress nitroxidativo. Estes resultados são também úteis para investigações futuras e uma contribuição importante para a discussão da relevância clínica de alteração do lipidoma e sua modelação em situações de stress nitroxidativo. No geral, este trabalho constitui avanço na análise e compreensão do efeito do stress nitroxidativo nos lípidos e no lipidoma, e devido ao seu potencial significado biológico, do seu possível valor em diagnóstico e em terapêutica. |
URI: | http://hdl.handle.net/10773/29433 |
Aparece nas coleções: | UA - Teses de doutoramento DQ - Teses de doutoramento |
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