MS analytical strategies for identifying nitroxidative modifications in phospholipids

Abstract

Nitroxidized lipids are recognized as important bioactive molecules in physiological and pathophysiological conditions. They are generated in vivo by the reaction of lipids with reactive nitrogen species (RNS) under nitroxidative stress conditions. Nitrated fatty acids (NO2FAs) are the most studied nitroxidized lipids. NO2FAs were well-characterized in vitro and detected in vivo, in tissues and biofluids. They are associated with relevant biological roles, such as mediating anti-inflammatory, antioxidant, vasculoprotective, anti-hyperglycemic, antitumoral and cytoprotective activities. One of the main mechanisms for these activities is the covalent interaction of NO2FAs with proteins. Nitroxidized phospholipids were recently identified in vivo, namely in phosphatidylcholines and phosphatidylethanolamines. However, this subject remains largely unaddressed, although the first studies indicate that nitroxidized phospholipids also own significant biological activity. Moreover, the ability of nitroxidized phospholipids to form covalent adducts with peptides or proteins is not yet reported. Thus, the main goal of the work developed in this PhD thesis has been to contribute for the advancement of mass spectrometry (MS)-based analysis of nitroxidized phospholipids and their covalent adducts with proteins, by using in vitro models for the generation of new species. Also, the impact of nitroxidative stress in vivo lipidome has was studied by using liquid chromatography (LC)-MS and tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis. The data obtained using these approaches were then correlated with the studied pathological conditions, i.e., acute myocardial infarction and cancer-induced cachexia. In this work, state-of-the-art LC-MS and MS/MS platforms were used analysing nitroxidized phospholipids. In vitro assays were used to characterize for the first time nitroxidized species of cardiolipin, and adducts between nitro-phospholipids and peptides representing potential targets in proteins. Up to ten different nitroxidative modifications were identified for cardiolipin by LC-MS and MS/MS, by using their chromatographic behaviour, exact mass measurements and MS/MS fragmentation pathways. Adduction between nitro-phospholipids and glutathione was demonstrated, as confirmed by MS/MS analysis of the adducts using different MS instruments. Analysis of biological samples where nitroxidative stress was expected to occur, namely myocardial infarction and cachexia, was performed by HILIC-LC-MS and MS/MS lipidomics. These studies revealed a strong impact in the lipidic phenotype that allowed to classify between health and disease status. It also allowed to point out molecular species responsive to onset and progress of the disease, as PUFA-containing phospholipids, plasmalogens, and cardiolipins in myocardial infarction, or cardiolipins and phosphatidylserines in cachexia.In conclusion, these results contribute to the study of the effect of nitroxidative stress in the lipidome in different ways. They provide a database and protocols for implementation of in vivo detection of new nitroxidized phospholipids and their adducts with proteins. The profiling of the lipidome in biological samples under nitroxidative stress constitutes a reference to undertaking the challenge of detecting nitroxidized phospholipid in vivo and provided a perspective of the changes occurring in lipidome in clinical situations related to nitroxidative stress. These results are also useful to direct future investigation and contribute for the discussion on the clinical relevance of the modulation of the lipidome in health and disease. Overall, this work provides a step forward in the MS-based analysis and understanding of the effect of nitroxidative stress in lipids and the lipidome, and its potential biological significance, diagnostic value and therapeutic utility.

Os lípidos nitroxidados são moléculas bioativas que desempenham funções importantes em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Estes lípidos nitroxidados são formados in vivo pela reação de lípidos com espécies reativas de nitrogénio (RNS), em condições de stress nitroxidativo. Os ácidos gordos nitrados (NO2FAs) são os lipídos nitroxidados mais estudados. Os NO2FAs já foram caracterizados in vitro, e têm sido detetados in vivo, em tecidos e biofluidos. Estas moléculas têm sido associadas a funções biológicas relevantes, mediando atividades anti-inflamatórias, antioxidantes, vasculoprotetoras, anti-hiperglicémicas, antitumorais e citoprotetoras. Um dos principais mecanismos relacionados com estas atividades é a interação covalente dos NO2FAs com proteínas. Os fosfolípidos nitroxidados foram recentemente identificados in vivo, nomeadamente as fosfatidilcolinas e as fosfatidiletanolaminas. No entanto, este campo de investigação permanece pouco explorado, apesar de os primeiros estudos indicarem que os fosfolipídos nitroxidados também possuem atividade biológica significativa. Além disso, a capacidade dos fosfolipídos nitroxidados formarem aductos covalentes com peptídeos ou proteínas ainda não foi reportada. Assim, o principal objetivo do trabalho desenvolvido nesta tese de doutoramento foi o desenvolvimento da análise de fosfolipídos nitroxidados e seus aductos covalentes com proteínas utilizando a espectrometria de massa (MS) e modelos in vitro para a geração de novas espécies. Além disso, foi estudado o impacto do stress nitroxidativo in vivo no lipidoma por análise cromatografia liquída associada à MS (LC-MS) e e espectrometria de massa tandem (MS/MS). Os resultados foram correlacionados com condições patológicas em estdo,i.e., o enfarte agudo do miocárdio e a caquexia induzida por cancro. Assim, neste trabalho, foram utilizadas plataformas de LC-MS e MS/MS de última geração para a análise de fosfolipídos nitroxidados. Foram desenvolvidos ensaios in vitro para caracterizar, pela primeira vez, espécies de cardiolipina nitroxidada bem como aductos entre nitro-fosfolipídos e péptidos representando potenciais alvos em proteínas. Foram identificadas dez modificações nitroxidativas diferentes para a cardiolipina, utilizando a LC-MS e MS/MS utilizando diversos critérios tais como o seu comportamento cromatográfico, medições exatas de massa e as vias de fragmentação em MS/MS. A adição entre nitro-fosfolipídios e a glutationa foi demonstrada, como confirmado pela análise MS/MS dos aductos usando diferentes espectrómetros de massa. O estudo de amostras biológicas ondeé esperada a presença de stress nitroxidativo, nomeadamente, enfarte do miocárdio e caquexia, foi realizado através da análise lipidómica com LC-MS e MS/MS. Esses estudos revelaram um forte impacto do stress nitroxidativo no fenótipo lipídico, que permitiu a diferenciação entre o estado saudável e patológico. Também foi possívelidentificar espécies moleculares que respondem ao início e progressão da doença, como os fosfolipídos contendo ácidos gordos poliinsaturados, plasmalogénios e cardiolipinas em caso de enfarte do miocárdio, ou as cardiolipinas e fosfatidilserinas na caquexia. Em conclusão, estes resultados contribuem para o desenvolvimento da estudo do efeito do stress nitroxidativo no lipidoma em diversas condiçoes fisiológicas e patológicas e constituem um banco de dados e protocolos para a implementação da deteção in vivo de novos fosfolipídios nitroxidados e seus adutos com proteínas. Adicionalmente, a caracterização do lipidoma em amostras biológicas sob stress nitroxidativo supõe uma referência para detetar fosfolípidos nitroxidizados in vivo e fornece uma perspetiva das mudanças que ocorrem no lipidoma, em situações clínicas relacionadas com o stress nitroxidativo. Estes resultados são também úteis para investigações futuras e uma contribuição importante para a discussão da relevância clínica de alteração do lipidoma e sua modelação em situações de stress nitroxidativo. No geral, este trabalho constitui avanço na análise e compreensão do efeito do stress nitroxidativo nos lípidos e no lipidoma, e devido ao seu potencial significado biológico, do seu possível valor em diagnóstico e em terapêutica.