Selecção e caracterização de mini-anticorpos recombinantes anti-ciprofloxacina

Abstract

Este trabalho teve como objectivo central a obtenção de mini-anticorpos recombinantes com especificidade para o antibiótico ciprofloxacina (CPFX). A utilização em saúde humana, animal e vegetal deste antibiótico tornou-o, à semelhança de outros, um problema de contaminação ambiental. Actualmente, o doseamento de CPFX em amostras é feito, na maioria das vezes, por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), o que é um método bastante moroso. Assim, há grande interesse em desenvolver métodos alternativos, rápidos e sensíveis para detecção daquele composto. Imunoensaios com recurso a anticorpos recombinantes, ou fragmentos de anticorpos, é uma via interessante e esta constitui o objectivo último desta investigação. Para tal, neste trabalho escolheu-se efectuar uma selecção numa biblioteca de fagos (Griffin.1) que expressam mini-anticorpos de cadeia única (scFv`s) à sua superfície (denominados phAbs), para isolar alguns com afinidade para CPFX, através da técnica de phage display. O processo exigiu, num primeiro passo, a imobilização da CPFX num suporte sólido, tendo-se optado por esferas magnéticas. Efectuou-se a ligação covalente entre o grupo carboxílico da CPFX e os grupos amina à superfície das esferas por reacção com carbodiimida. Conseguiu-se uma aparente saturação dos grupos amina com CPFX. Para quantificação de CPFX nas soluções, foi previamente desenvolvido e validado um método de HPLC que se distingue de outros métodos reportados. Seguidamente, efectuou-se um protocolo de selecção sobre a biblioteca de minianticorpos acima referida utilizando as esferas derivatizadas com CPFX. Em vários ciclos sucessivos de selecção, a eluição das esferas de phAbs (específicos) foi efectuada com quantidades decrescentes de CPFX livre em solução, e com tempos de eluição também decrescentes, de modo a promover uma pressão selectiva cada vez mais apertada. Desenvolveu-se também um método para separar phAbs eluídos da CPFX em solução, baseado em cromatografia de exclusão molecular. Para testar a afinidade e especificidade de phAbs, desenvolveu-se com sucesso métodos de ELISA que empregam as esferas magnéticas derivatizadas com CPFX e os próprios phAbs (em vez dos mini-anticorpos separados dos fagos). Após quatro ciclos de selecção, analisaram-se por ELISA 32 clones, tendo-se detectado cinco clones com afinidade por CPFX. Procedeu-se, então, à sequenciação dos genes dos fragmentos daqueles cinco clones, mas só três deles tiveram resultados conclusivos. Curiosamente, todos três correspondem a fragmentos VL, e não a scFv`s, sendo que dois são da mesma família (VKII). Produziram-se os phAbs dos três clones e analisaram-se em ELISA competitiva, a fim de identificar aqueles que ligam CPFX em solução, e não apenas CPFX imobilizada nas esferas. Apenas dois dos phAbs satisfizeram este critério, mas só um (correspondente ao clone 406) mostrou um comportamento regular na ELISA. Este ensaio mostrou um limite de detecção de CPFX de 9,3 nM. Analisou-se também por ELISA competitiva a especificidade deste phAb, verificando-se que ele possuía reactividade cruzada com outras três fluoroquinolonas, mas não com outros dois antibióticos não-quinolonas. Os fragmentos VL, separados dos fagos, do clone 406 foram produzidos com sucesso por cultura de E. coli em pequena escala, conforme confirmado por análise dot blot. Este conjunto de resultados sugere como trabalho futuro a produção em maior escala de fragmentos isolados, bem como o desenvolvimento e a validação de imunoensaios para detecção e quantificação de CPFX em amostras ambientais.

ABSTRACT: The main objective of this research was to obtain recombinant mini-antibodies with specificity for the antibiotic ciprofloxacin (CPFX). The use of this drug in human, animal and plant health turned it an environmental problem, like many other antibiotics. Currently, quantification of CPFX is carried out most often by high performance liquid chromatography (HPLC), which is a time demanding method. Therefore, it is of interest to develop rapid, sensitive, alternative methods for detection of that compound. Immunoassays using recombinant antibodies, or their fragments, constitute an interesting route and this is the ultimate goal of this research. For that purpose, the strategy followed was to carry out a selection procedure in a library of phage particles (Griffin.1) that express single-chain antibodies (scFv`s) at their surface (named phAbs), in order to isolate a few with affinity for CPFX. This process required, as a preliminary step, the immobilization of CPFX on to a solid support. Magnetic beads were chosen for this purpose. The covalent linkage between CPFX molecules and amine groups at the surface of the beads was carried out by a carbodiimidemediated reaction. An apparent saturation of the amine groups in the beads was attained. In order to quantify CPFX in the solutions, a HPLC protocol, different from others previously reported in the literature, was developed and validated. Next, a selection procedure was executed on the above mentioned library and using the CPFX-derivatized beads. In the various cycles of selection, the elution of (specific) phAbs from the beads was attained with decreasing quantities of free CPFX in solution, and with decreasing contact times, in order to provid an increasing selective pressure. A method to separate the eluted phAbs from CPFX in solution based on size-exclusion chromatography was also developed. In order to test the affinity and specificity of phAbs, ELISA methods employing the magnetic beads-CPFX and the phAbs themselves (instead of the mini-antibodies separated from the phages) were successfully developed. After four rounds of selection, 32 clones were analysed by ELISA. Of these, five showed affinity for CPFX. The sequencing of the genes of the antibody-fragments in those five clones was then carried out, but with conclusive results only for three of them. Curiously enough, all three correspond to VL fragments, and not to scFv`s. Two of them belong to the same family (VKII). The phAbs of the three clones were produced and then tested in competitive ELISA, in order to identify those that bind CPFX in solution, besides CPFX bound to the beads. Only two of the phAbs fulfilled this criterion, but only one (corresponding to clone 406) showed a regular pattern in ELISA. This assay showed a limit of detection of CPFX of 9.3 nM. The specificity of this phAb was also studied by competitive ELISA. It was observed that it has cross-reactivity with three other fluoroquinolones, but not with two other antibiotics non-quinolones. VL fragments, separated from the phage, from the clone 406 were successfully produced by E. coli culture in small scale, as confirmed by dot blot analysis. This set of results suggest as future work the production in larger scale of isolated antibody fragments, followed by the development and validation of immunoassays for detecting and quantifying CPFX in environmental samples.