Antifungal drug resistance driven by mistranslation in yeast

Abstract

Antifungal drug resistance has become a severe clinical problem and new targets for the development of new antifungal drugs need to be discovered. Ongoing work in our laboratory indicates that codon mistranslation due to codon ambiguity accelerates antifungal drug resistance in the human pathogen Candida albicans. The present work aimed to elucidate if non pathogenic yeasts behave similarly. Therefore, mistranslation was artificially induced in Saccharomyces cerevisiae strains by the expression of chimeric tRNAs. Each of the constructed strains carried a low-copy number plasmid, containing a C. albicans tRNAUGA Ser gene, whose anticodon was changed by site-directed mutagenesis, in order to replace it by several other anticodons. As the identity elements of the tRNA remained unchanged it was still acylated with serine. These mutant tRNAs are expected to compete with the native ones and have an impact on the proteome. To verify if mistranslation leads to an advantageous phenotype regarding antifungal drug resistance, cells were exposed to different antifungals. Additionally, microarray analyses were performed on non-exposed mutant strains in order to detect a possible predisposition to resist antifungal exposure.

A resistência a antifúngicos é, hoje em dia, um problema sério a nível clínico, pelo que há necessidade de descobrir novos alvos que possibilitem o desenvolvimento de novos antifúngicos. Investigação a decorrer no nosso laboratório indica que a ambiguidade no reconhecimento de codões em Candida albicans, um patogénio humano, acelera a resistência a antifúngicos. O presente trabalho teve como objectivo elucidar se a ambiguidade em leveduras não patogénicas aumenta a resistência a antifúngicos. Para tal foi induzida artificialmente ambiguidade no reconhecimento de diferentes codões em Saccharomyces cerevisiae. As estirpes resultantes possuem um plasmídeo de replicação reduzida contendo um tRNAUGA Ser de C. albicans sujeito a mutagénese dirigida, de modo a mutar o anticodão. Os novos anticodões reconhecem codões de diferentes aminoácidos mas o tRNA mantém os elementos de reconhecimento, sendo acilado com serina. Os tRNAs mutantes vão competir com os nativos, formando-se um proteoma estatístico. Para verificar se estas estirpes apresentam um fenótipo mais vantajoso em resposta a variados antifúngicos, foram expostas a diferentes classes dos mesmos. Adicionalmente, foram analisados microarrays de estirpes não expostas a qualquer stress adicional, de modo a perceber se as mesmas apresentam já tendência para responderem de modo diferente perante os diferentes antifúngicos.