Structural studies of human p22HBP protein

Abstract

The present work aimed to perform the first structural studies on human p22HBP protein by NMR and at same time to study the interaction of some tetrapyrrole with this protein by fluorescence quenching. To accomplish these objectives we had to start by optimizing the conditions for producing and purifying human p22HBP. Parameters such as the moment of induction, the inducer concentration and time for cell lysis were evaluated. After the optimization, cultures of p22HBP in M9 minimal media enriched with 15NH4Cl and 13C-glucose were grown. The first spectra of human p22HBP and the backbone resonance assignment, first and most important step in any protein structural elucidation by NMR, were performed. Finally, interaction studies were performed using chemical shift mapping and fluorescence quenching methods, and they indicated that the tetrapyrrole binding site is formed by the same residues described in previous studies; and the dissociation constant by which human p22 HBP binds PPIX and hemin was determined as being in the nanomolar range, being this interaction of high affinity.

O presente trabalho teve por objectivos realizar os primeiros estudos estruturais da versão humana da proteína p22HBP por RMN e ainda estudar a interacção de várias porfirinas com esta proteína usando a extinção da fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano. A realização destes objectivos pressupõe a optimização das condiçoes de produção e purificação da p22HBP humana, tendo-se testado para isso parâmetros com influência no total de proteína produzida e purificada. Esses parâmetros são o momemto da indução, a concentração do agente indutor e o tempo de lise celular por sonicação. Após a optimização das condições referidas, a produção da p22HBP tem lugar num meio de cultura contendo isótopos como 15NH4Cl e 13C-glucose, de modo a incorporar nas proteínas esses núcleos activos em RMN. O passo seguinte consistiu na identificação das ressonâncias da cadeia principal da p22HBP humana, primeiro passo e determinante na elucidação da estrutura tridimensional de qualquer proteína, por RMN. Por fim, foram realizados estudos de interacção usando o mapeamento das diferenças de desvio químico devidas à interacção com as porfirinas e, ainda a fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano para determinar a afinidade da proteína em relação às porfirinas. Estes estudos indicaram que o sítio de interacção presente na proteína é composta pelos mesmos resíduos previamente identificados no estudo com a murine HBP; para além disso, a constante de dissociação para as porfirinas situa-se na gama dos nanomolares, havendo portanto uma elevada afinidade.