Teores de vibrios halófilos patogénicos humanos em ostras, por NMP-PCR

Abstract

O presente estudo foi levado a cabo com o objectivo de determinar a ocorrência e os níveis de Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus (total e potencialmente patogénico) em ostras naturalmente contaminadas, usando dois métodos diferentes de Número Mais Provável (NMP) em conjugação com a técnica de reacção em cadeia da polimerase (PCR) de modo a seleccionar o mais apropriado para análise de rotina. As ostras foram adquiridas em lojas e supermercados locais. Os valores de V. vulnificus (portador do gene que codifica a hemolisina/citolisina da bactéria - vvhA), V. parahaemolyticus total (portador do gene específico da espécie – toxR) e V. parahaemolyticus potencialmente patogénico (portador dos genes que codificam as hemolisinas directa termoestável – tdh e directa termoestável relacionada – trh) foram determinados usando dois métodos de NMP-PCR: (1) enriquecimento em água peptonada alcalina (APW) seguido de PCR (APW-PCR); e (2) enriquecimento em APW e isolamento em agar de tiossulfato citrato bílis sacarose (TCBS) seguido de confirmação das estirpes por PCR (TCBS-PCR). Foi detectado V. vulnificus em quatro amostras de ostras pelo método APWPCR e em três amostras pelo método TCBS-PCR, mas nunca nas mesmas amostras. Foi possível encontrar V. parahaemolyticus em 14 amostras pelo método APW-PCR e em 13 amostras pelo método TCBS-PCR. Quanto aos factores de virulência, foi possível detectar o gene tdh em uma amostra somente pelo método APW-PCR; o gene trh foi detectado em cinco amostras por ambos os métodos, mas nem sempre na mesma amostra. O método APW-PCR demonstrou ser o mais adequado para detectar a presença de V. parahaemolyticus total em ostras, uma vez que gerou maior número de amostras positivas e detectou teores mais elevados, no entanto, recomenda-se o recurso a ambos os métodos para a detecção dos factores de virulência do V. parahaemolyticus e para a detecção de V. vulnificus.

ABSTRACT: The present study was carried out to determine the occurrence and levels of Vibrio vulnificus and total and potentially pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in naturally contaminated oysters, using two Most Probable Number – Polymerase Chain Reaction (MPN-PCR) different methods in order to select the most appropriate for routine analysis. Oysters were collected from local stores and supermarkets. V. vulnificus (carrying the hemolysin/ cytolysin vvhA gene), total V. parahaemolyticus (carrying the species-specific toxR gene) and potentially pathogenic (carrying the thermostable direct hemolysin - tdh and TDH-related hemolysin - trh genes) V. parahaemolyticus were enumerated by two MPN-PCR methods: (1) Alkaline Peptone Water (APW) enrichment followed by PCR (APW-PCR); and (2) APW enrichment plus isolation on Thiosulfate Citrate Bile Sucrose (TCBS) agar followed by PCR strain confirmation (TCBS-PCR). V. vulnificus was found in four oyster samples by the APW-PCR method and in three by the TCBS-PCR method, but never in the same samples. V. parahaemolyticus was found in 14 oyster samples by the APW-PCR method and in 13 by the TCBS-PCR method. Concerning virulence factors, tdh positive organisms were only detected by the APW-PCR method in one sample; trh positive organisms were found in five oyster samples by both methods though not always in the same sample. The APW-PCR method has shown to be more adequate for the detection of total V. parahaemolyticus in oysters, since it yielded a larger number of positive samples, however, for detection of V. parahaemolyticus virulence factors and V. vulnificus, both methods should be used.