Identification of regulatory kinases of the FoF1 ATP synthase beta subunit

Abstract

In higher eukaryotes, approximately 90% of cellular ATP is produced by ATP synthase, a mitochondrial enzymatic complex. Numerous post-translational modifications, particularly phosphorylation, were reported for all ATP synthase subunits, both in physiological and pathological states. Still, the impact of these modifications for ATP synthase regulation or the signaling pathways involved remains ill-defined. Previously, two phosphorylation sites were identified in the catalytic β subunit of the FoF1 ATP synthase (Atp2) of S. cerevisiae, Threonine 124 (Thr) and Thr317. Phosphorylation of these residues resulted in Atp2p stabilization, increased ATP synthase activity and mitochondrial respiration. Yet, the kinases involved in the phosphorylation of these residues, conserved across species, are unknown. Using S. cerevisiae as a model, the aim of this study was thus to identify the kinase(s) involved in the phosphoregulation of the ATP synthase β subunit. Using bioinformatic motif prediction, four kinases were selected as potential Atp2 regulators: Cdc5, Ipl1, Hrr25 and Pkc1. Cdc28 was also evaluated since a genetic interaction with Atp2 was previously observed. Kinase expression was manipulated to evaluate possible effects in Atp2p phosphorylation and Atp2p levels. Zn2+Phos-Tag™ SDS-PAGE was optimized and used to detect Atp2p phosphorylation. The overexpression of Pkc1, Ipl1 and Cdc5 resulted in increased Atp2 phosphorylation. Overexpressing Ipl1 also caused an increase in Atp2p levels, consistent with increased phosphorylation, while a minor increase was observed for Cdc5. The role of Cdc5 on mitochondrial function was further evaluated. Overexpression of Cdc5 resulted in a significant increase in mitochondrial respiration and repressing Cdc5 prevented growth in respiratory media, indicating that Cdc5 plays an important, previously unsuspected role in mitochondrial function. Though overall evidence supports a role for Cdc5 in Atp2 regulation, further studies are required to confirm that Cdc5 is, in fact, a direct phosphoregulator of Atp2. Identification of Atp2p regulatory kinases will improve our understanding of the signalling pathways regulating ATP synthase function. Since many pathologies are associated with dysfunction of this vital complex, identification of its regulatory kinases can provide, in the long run, new therapeutic targets.

Em eucariotas superiores, cerca de 90% do ATP celular é produzido pela ATP sintase, um complexo enzimático mitocondrial. Várias modificações pós tradução, especialmente fosforilação, foram descritas em todas as subunidades da ATP sintase, tanto em condições fisiológicas normais como patológicas. No entanto, o impacto destas modificações na regulação da ATP sintase ou as vias de sinalização envolvidas precisam ainda de elucidação. Recentemente, dois locais de fosforilação foram identificados na subunidade β, catalítica, da ATP sintase (Atp2) em S. cerevisiae, Treonina (Thr) 124 e Thr317. A fosforilação destes resíduos promove a estabilização de Atp2p, e o aumento da atividade da ATP sintase e da respiração mitocondrial. Porém as cinases envolvidas na fosforilação destes resíduos, conservados entre espécies, são ainda desconhecidas. Usando S. cerevisiae como modelo, o objetivo deste estudo consistiu em identificar cinase(s) envolvida(s) na fosforegulação da subunidade β da ATP sintase. A utilização de ferramentas bioinformáticas de algoritmo preditivo de locais de fosforilação, permitiu a seleção de 4 cinases como potenciais reguladores de Atp2p: Cdc5, Ipl1, Hrr25 e Pkc1. Foi ainda avaliada a Cdc28, após observação prévia de interação genética com Atp2p. A expressão das cinases foi manipulada de forma a avaliar possíveis efeitos na fosforilação e nos níveis de Atp2p. O método Zn2+Phos-Tag™ SDS-PAGE foi otimizado e utilizado para deteção da fosforilação de Atp2p. A sobrexpressão de Cdc5, Ipl1 e Pkc1 levou a um aumento da fosforilação de Atp2p. A sobrexpressão de Ipl1 aumentou também os níveis de Atp2p, consistentes com aumento de fosforilação, enquanto que um aumento pouco significativo foi observado para Cdc5. O papel da Cdc5 na função mitocondrial foi estudado, sendo que a sua sobrexpressão causou um aumento significativo da respiração mitocondrial e a repressão de Cdc5 inibiu o crescimento em meio respiratório, sugerindo que a Cdc5 possa ter um efeito regulador importante na função mitocondrial. Mais estudos são necessários para determinar se Cdc5 é um fosforegulador direto de Atp2p. A identificação de cinases reguladoras de Atp2p contribuirá para o conhecimento das vias de sinalização que regulam a função da ATP sintase. Visto que várias patologias estão associadas à disfunção deste complexo essencial, a identificação das suas cinases reguladoras pode nomear, a longo prazo, novos alvos terapêuticos.