Tolerance of amphibians and its skin symbiotic bacteria to increased salinity and acid mine drainage contamination

Abstract

Salinity and Acid Mine Drainage (AMD) constitute environmental threats that may lead to biodiversity losses and ecosystems disturbances. The main goal of this study intended to assess the adverse effects that these two types of contamination may exert on amphibians and on its skin bacterial community. For this, the sensitivity of the skin microbiome, collected at different natural populations of Pelophylax perezi, was tested primarily to AMD, by exposing the skin bacteria isolates to serial AMD dilutions through two methodologies: Wells Diffusion and Microdilution methods. Microdilution method revealed to be more suitable to evaluate the sensitivity of the bacteria, since it allowed to better discriminating the AMD-sensitivity among bacteria. Therefore, only this method was used to proceed with the assessment of sensitivity of the skin bacterial community to NaCl. The majority of the isolates seemed to be tolerant to both pollutants (AMD and NaCl) revealing average values of the dilution/concentration causing a reduction of 20% in bacteria growth (EC20) to AMD and NaCl of 62.4% and 13.5 g/L, respectively. Tadpole’s sensitivity was assessed by exposing them, for 168 h, to different concentrations/dilutions of NaCl and AMD, respectively. In general, results showed that tadpole’s sensitivity to these pollutants was higher than its intrinsic bacterial community, in what concerns to P. perezi. Additionally, Xenopus laevis tadpoles also showed a higher sensitivity to both stressors, comparatively to the skin bacterial isolates. Between amphibian species, no differences were observed in the sensitivity to NaCl and AMD sensitivity. The capacity of amphibian skin bacteria to acquire tolerance to NaCl over a succession of exposures to low levels of this chemical was also assessed. For this, the bacteria isolate Erwinia toletana was exposed for six weeks to LB medium or to the EC10 for NaCl (18 g/L). After exposure for six weeks, the sensitivity to NaCl of the bacteria was reassessed by running again the Microdilution growth inhibition assay. Additionally, the metabolic degradation of carbon compounds were also tested to understand if there were differences on metabolic mechanisms. Results confirmed that tolerance to NaCl increased, by presenting a shift on EC20 from an initial value of 20 g/L (18.5-21.9) (for E. toletana exposed for six weeks to LB medium) to 30.8 g/L (25.4-36.3) (for E. toletana exposed for six weeks to the EC10 of NaCl). Also, the metabolic processes shown to be different between E. toletana continued exposed to LB or to NaCl, suggesting that E. toletana, when exposed to low levels of salinity (EC10), use or activated different metabolic pathways to deal with osmotic stress caused by high salinity. The study of bacterial isolates sensitivity to contaminants for bioaugmentation application in amphibians exposed to the same contaminants, present in the environment, could constitute an improvement of amphibian’s immunity defense.

A salinização e drenagem ácida (AMD) constituem uma ameaça no meio ambiente repercutindo-se na perda de biodiversidade e equilíbrio nos ecossistemas. O objetivo principal deste estudo consistiu em analisar os efeitos adversos de NaCl e AMD em anfíbios e na comunidade bacteriana da sua pele. Assim, a sensibilidade do microbioma, recolhido em diferentes populações de Pelophylax perezi, foi testada primeiramente a AMD, através de exposição a diferentes diluições recorrendo a duas metodologias: Difusão por poços e o teste por Microdiluição. O método de Microdiluição demonstrou ser mais adequado para avaliar a sensibilidade das bactérias uma vez que permitiu reunir mais informação da sensibilidade, resultados mais precisos e melhor discriminação das categorias de sensibilidade das bactérias a AMD. Posteriormente, e dadas as vantagens mencionadas, avaliou-se a sensibilidade das bactérias da pele a NaCl, apenas pelo método de Microdiluição. Observaram-se diferenças significativas na sensibilidade dos isolados a NaCl e AMD e diferenças entre os locais de amostragem. A maioria dos isolados revelou ser tolerante aos dois poluentes tendo-se calculado valores médios das diluições/concentrações que provocaram 20% de inibição no crescimento (EC20) das bactérias de 62.4% e 13.5 g/L para AMD e NaCl, respetivamente. A sensibilidade de girinos foi testada por exposição a várias concentrações e diluições de NaCl e AMD, respetivamente, durante 168h. De uma forma geral a sensibilidade dos girinos de P. perezi, foi superior à sensibilidade da comunidade bacteriana intrínseca da pele. Comparando a sensibilidade dos isolados dois tipos de poluição com a sensibilidade de X. laevis, a sensibilidade do anfíbio foi maior que a dos isolados. Relativamente à sensibilidade das duas espécies de anfíbios não se verificaram diferenças significativas quando expostos aos dois tipos de contaminação. Por fim, foi analisada a capacidade de uma bactéria do microbioma da pele de anfíbios, adquirir tolerância a NaCl, através da sua exposição continua a baixas concentrações deste composto. Para tal, o isolado Erwinia toletana foi exposto, durante seis semanas a LB ou à concentração de NaCl que induz 10% de inibição no seu crescimento (18 g/L). Após a exposição continua, foi realizado novamente um teste de sensibilidade a NaCl usando o método de Microdiluição. Seguidamente, realizou-se também um teste de metabolismo de compostos de carbono para analisar diferenças no processo metabólico. Os resultados confirmaram um aumento de tolerância da bactéria a NaCl, apresentando um aumento do EC20 de 20 g/L (18.5-21.9) (6ª geração exposta a meio LB) para 30.8 g/L (25.4-36.3) (6ª geração exposta ao EC10 de NaCl). As respostas a nível dos processos metabólicos apresentaram diferenças entre os isolados expostos durante seis semanas a LB ou a NaCl, no tipo de composto utilizado. Estes resultados sugerem que E. toletana, quando exposta a níveis baixos de NaCl (EC10), utilize vias metabólicas que possam colmatar o stress induzido pela presença de NaCl no meio. Assim, o estudo de sensibilidade de bactérias a contaminantes, para fins de bioaumentação em anfíbios expostos aos mesmos contaminantes no meio ambiente, poderá contribuir para uma maior defesa a nível do sistema imunitário.