Identification of therapeutic biomarkers in melanoma

Abstract

O melanoma deriva da transformação maligna de melanócitos e é frequentemente encontrado na pele e na região ocular. A identificação de marcadores moleculares que inequivocamente indiquem a agressividade do tumor ou que possam prever a resposta/resistência a uma terapia é uma prioridade da comunidade científica que estuda esta patologia. Mutações do gene do BRAF, maioritariamente V600E e mutações do gene do NRAS têm sido implicadas no desenvolvimento de melanoma cutâneo. Enquanto, mutações nos genes do GNAQ e GNA11 são encontradas com elevada frequência em melanomas uveais. Todas estas mutações podem levar à activação da via de sinalização das MAP cínases, conduzindo ao aumento da proliferação celular O objectivo deste estudo foi a identificação de mutações genéticas frequentes como indicadores de prognósticos ou de previsão de resposta a uma terapia de inibição da via do mTOR e avaliar o potencial de efectores desta via como biomarcadores terapêuticos em melanomas cutâneos e oculares. A existência de alterações genéticas nos genes do BRAF e NRAS foi determinada em 13 casos de melanoma cutâneo. O estado mutacional dos genes GNAQ e GNA11 foi avaliado em 34 casos de melanoma ocular. A análise mutacional foi realizada com recurso a PCR e sequenciação. A associação entre o estado mutacional e as características clínico-patológicas foi também estudada. Um conjunto de linhas celulares de melanoma com diferentes perfis genéticos foi tratado com um fármaco inibidor do mTOR, RAD001. A proliferação celular e apoptose foram avaliadas com os ensaios SRB e TUNEL, respectivamente, a expressão de efectores da via do mTOR foi detectada por immunoblotting. G361, uma linha celular derivada de melanoma cutâneo com mutação BRAFV600E, apresentou a maior inibição de crescimento após tratamento com RAD001. RAD001 não induziu um aumento de apoptose em nenhuma das linhas celulares utilizadas neste estudo, sugerindo que o RAD001 não induz alterações no processo de apoptose. Este estudo apresenta a mutação BRAFV600E como um possível marcador terapêutico do fármaco, RAD001, para pacientes com melanoma cutâneo mas não para pacientes com melanoma ocular, podendo no futuro ser uma ferramenta útil na selecção de pacientes para uma terapia baseada na inibição do mTOR.

Melanoma results from the malignant transformation of melanocytes and is frequently found in the skin and ocular region. The identification of molecular biomarkers, which unequivocally indicate the aggressiveness of the tumour or predict the response/resistance to a therapy, is of high priority in the field of melanoma research. BRAF gene mutations, predominantly V600E, and mutations in the NRAS gene have been implicated in the development of cutaneous melanoma. Mutations in the GNAQ and GNA11 genes are found frequently in ocular melanoma, particularly in the uveal subtype. These mutations can lead to the activation of the MAPK pathway, which can lead to growth-promoting activities. The aim of this study was to identify frequent mutations that can be used as prognosis or predictive markers for mTOR pathway inhibition. In addition, the potential of mTOR pathway effectors as therapeutic biomarkers in cutaneous and ocular melanoma was also addressed. Genetic alterations in the BRAF and NRAS genes were determined in 13 cutaneous melanoma tumour samples and GNAQ and GNA11 genes mutational status were evaluated in a series of 34 tumour samples of ocular melanoma. Mutational analysis was done by PCR/Sequencing. The mutational status and its correlation to clinical-pathologial features was then assessed. A panel of melanoma cell lines with different BRAF, GNAQ and GNA11 mutational status were treated with RAD001, an mTOR pathway inhibitor. Cell viability and apoptosis were assessed by SRB assay and TUNEL assay, respectively, mTOR pathway effectors expression levels were detected by immunoblotting. G361, a cutaneous melanoma-derived cell line, which harbours BRAFV600E, showed the highest level of cell growth inhibition after treatment with RAD001. RAD001 did not induce increased levels of apoptosis in any of the cell lines treated, suggesting that RAD001 does not induce alterations in the apoptosis process. This study supports BRAF mutational status as a possible predictive biomarker to RAD001 treatment in cutaneous melanoma but not in ocular melanoma patients and as a promising tool to select patients to mTOR inhibition therapy.