FTIR: uma potencial metodologia para o rastreio de marcadores de envelhecimento no DNA

Abstract

Com o aumento da esperança média de vida, estudar o envelhecimento saudável tem vindo a tornar-se mais relevante. Muitas das perdas funcionais relacionadas com a idade ocorrem através dos danos oxidativos e um dos biomarcadores mais utilizados para estudar estes danos, também usado como preditor da idade biológica, é a quantidade de 8-oxo-2´-deoxoguanosina (8- OHdG). Este composto corresponde à versão oxidada mais frequente das guaninas do DNA, e a sua disponibilidade e estabilidade a longo prazo é superior à de outros biomarcadores. As técnicas utilizadas para a medição do stresse oxidativo no DNA, em sua maioria, apresentam diversas desvantagens, para além de degradarem a amostra, apresentam um custo elevado e envolvem procedimentos demorados ou necessitam de serem complementadas com outras técnicas. Para tentar ultrapassar estas limitações este trabalho propõe o uso de espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR) para a medição de níveis de 8-OhdG em amostras humanas com DNA. Esta técnica foi utilizada devido à sua sensibilidade, ao reduzido tempo de análise, ao baixo risco de contaminação das amostras, ao facto de necessitar pouca amostra e ter baixo custo. No presente estudo recorreu-se a ELISA como método de validação, que se comparou como FTIR, para a quantificação do analito 8-OhdG, em amostras de urina e de DNA extraído e purificado. Apesar de não ter sido possível obter uma boa correlação entre os resultados obtido por ambas as técnicas analíticas, foi possível tanto a deteção quanto a quantificação deste composto, por FTIR, em ambos os tipos de amostras. Com este trabalho foi possível definir as condições experimentais necessárias para a utilização do FTIR na quantificação de 8-OHdG tendo-se estabelecido um protocolo laboratorial, que deverá ser utilizado como ponto de partida em estudos futuros. Para além disso, os espectros provenientes do FTIR foram explorados para testar a sua utilidade na determinação de outros biomarcadores relevantes em simultâneo.

With the increase in average life expectancy, studying healthy aging has become more relevant. Many of the age-related functional losses occur through oxidative damage and one of the most used biomarkers to study these damages, also used as a predictor of biological age, is the amount of 8-oxo-2´- deoxoguanosine (8-OHdG). This compound corresponds to the most frequent oxidized version of DNA guanines, and its availability and long-term stability is superior to that of other biomarkers. The techniques used to measure oxidative stress in DNA, for the most part, have several disadvantages, in addition to degrading the sample, presenting a high cost and involving lengthy procedures or need to be complemented with other techniques. In order to try to overcome these limitations this work proposes the use of infrared spectroscopy with Fourier transform (FTIR) to measure 8-OhdG levels in human samples with DNA. This technique was used due to its sensitivity, the reduced analysis time, the low risk of contamination of the samples, together with the fact that it requires little sample and has a low cost. In the present study, ELISA was used as a validation method, and results were compared to those from FTIR, for the quantification of the 8-OhdG analyte, in both urine and extracted DNA samples. Although it was not possible to obtain a good correlation between the results obtained by both analytical techniques, it was possible to detect and quantify this compound, by FTIR, in both types of samples. With this work it was possible to define the experimental conditions necessary for the use of FTIR in the quantification of 8-OHdG, and a laboratory protocol was established, which should be used as a starting point in future studies. In addition, the spectra from the FTIR were explored to test their usefulness in determining other relevant biomarkers at the same time.