Carbapenemase-producing bacteria in urban aquatic environments

Abstract

Antibiotic resistance is an increasingly serious problem globally. If nothing is done, is predictable a future where infections that are currently easily treatable would kill millions of people each year. Carbapenems are a group of last-resort antibiotics, considered key drugs in the treatment of severe infections. The spread of genes encoding carbapenem-hydrolyzing enzymes through mobile genetic elements is a serious threat to Public Health. Antibiotic-resistant bacteria (ARB) and antibiotic-resistance genes (ARG) are often associated with clinical settings and little is known about their presence in urban aquatic systems located in recreational areas, where humans and animals may be easily exposed. This study aimed to assess the prevalence and characterize carbapenemase-producing bacteria in urban aquatic systems. The prevalence of imipenem and cefotaxime-resistant bacteria was monitored in five urban ponds and in an urban estuarine channel over six months. Over this time, one urban pond showed consistently the highest rate of both imipenem- and cefotaxime-resistant bacteria. Imipenem-resistant bacteria were detected only in 2 urban ponds and in the estuarine channel site. A collection of 30 imipenem-resistant isolates was established, which were subsequently identified and submitted to molecular typing by BOX-PCR. These isolates were characterized regarding the antibiotic susceptibility, carbapenemase-encoding genes, plasmid content and mating assays. Three isolates were selected for whole genome sequencing and their resistome, mobilome and virulence related genetic determinants were evaluated. Isolates affiliated to Klebsiella (n = 1), Raoultella (n = 11), Enterobacter (n = 3), Citrobacter (n = 8) and Aeromonas (n = 7). Most of them were resistant to all β-lactam antibiotics tested, 76.6 % were multidrug-resistant organisms and none of the tested antibiotics was effective against all isolates. The presence of carbapenemase-encoding genes was detected in 27 isolates: blaKPC (n=20; 8 Citrobacter, 11 Raoultella and 1 Enterobacter); blaGES-5 (n=13; 6 Aeromonas, 5 Raoultella, 1 Enterobacter and 1 Klebsiella) and blaVIM-1 (n=1; Citrobacter). The simultaneous presence of two carbapenemase genes was observed (blaKPC and blaGES-5, n=6; blaKPC and blaVIM-1, n=1). Class 1 and 3 integrons were detected in 80 % and 36.7 % of the isolates, respectively. The presence of blaGES-5 was always associated with class 3 integrons. The whole genome analysis showed that blaKPC-3 was found associated to transposons and plasmids. Additional ARG were also detected (e.g catB3, aacA4-cr, qnrS1, sul1, dfrA14, tet(A) and macA). Some of the integrons detected harboured multiple ARG. Although it was not possible to obtain transconjugants through mating assays, the presence of conjugative plasmids was confirmed by WGS analysis. The presence of several virulence determinants was detected in sequenced genomes and these organisms were predicted as human pathogens. With this study, we concluded that some of the studied aquatic environments possess microbial loads above the desirable and that the detected ARB harbored both genetic determinants of resistance to carbapenems and to other classes of antibiotics, often associated with mobile genetic elements already linked to serious outbreaks, that may contribute to their spread among bacteria and between environments. Further studies are needed to elucidate the source of these ARG to try preventing their spread, in order to slow-down the problem of antibiotic resistance, especially the last-resort antibiotic resistance.

A resistência a antibióticos é um problema sério e crescente a nível global. Se nada for feito, prevê-se um futuro onde as infeções que atualmente são facilmente tratáveis poderão matar milhões de pessoas anualmente. Os carbapenemos são um grupo de antibióticos de último recurso, considerados antibióticos chave no tratamento de infeções graves. A disseminação de genes que codificam enzimas capazes de hidrolisar e inutilizar estes antibióticos, através de elementos genéticos móveis (EGM), constitui uma ameaça séria à Saúde Pública. As bactérias resistentes a antibióticos (BRA) e genes de resistência a antibióticos (GRA) são frequentemente associados ao âmbito hospitalar e pouco se sabe acerca da sua presença em pequenos lagos urbanos, situados em áeas recreativas, onde humanos e animais poderão ser facilmente expostos. Este estudo teve como objetivo avaliar a prevalência e caracterizar bactérias produtoras de carbapenemases em sistemas aquáticos urbanos. A prevalência de bactérias resistentes a cefotaxima e de bactérias resistentes a imipenemo foi avaliada em cinco pequenos lagos urbanos e num canal estuarino durante 6 meses. Durante esse tempo, um lago urbano mostrou consistentemente a maior taxa tanto de bactérias resistentes a imipenemo como de bactérias resistentes a cefotaxima. As bactérias resistentes a imipenemo foram detetadas apenas em 2 lagos urbanos e num canal estuarino. Estabeleceu-se uma coleção de 30 isolados resistentes a imipenemo, que foram posteriormente identificados e submetidos a tipagem molecular através de BOX-PCR. Estes isolados foram caracterizados com base em suscetibilidade a antibióticos, presença de genes que codificam carbapenemases, conteúdo plasmídico e ensaios de conjugação. Foram selecionados 3 isolados para sequenciação do genoma e os seus resistomas, mobilomas e genes associados a fatores de virulência foram avaliados. Os isolados afiliaram com Klebsiella (n = 1), Raoultella (n = 11), Enterobacter (n = 3), Citrobacter (n = 8) e Aeromonas (n = 7). A maioria deles eram resistentes a todos os antibióticos β-lactâmicos testados, 76,6 % eram organismos multirresistentes e nenhum dos antibióticos testados foi eficaz contra todos os isolados. A presença de genes que codificam carbapenemases foi detetada em 27 isolados: blaKPC (n=20; 8 Citrobacter, 11 Raoultella e 1 Enterobacter); blaGES-5 (n=13; 6 Aeromonas, 5 Raoultella, 1 Enterobacter e 1 Klebsiella) e blaVIM-1 (n=1; Citrobacter). Observou-se também a presença de dois genes que codificam carbapenemases em simultâneo (blaKPC e blaGES-5, n=6; blaKPC e blaVIM-1, n=1). Foram detetados integrões de classes 1 e 3 em 80 % e 36,7 % dos isolados, respetivamente. A presença do gene blaGES-5 esteve sempre associada a integrões de classe 3. A análise genómica mostrou que o gene blaKPC-3 se encontrava associado a transposões e plasmídeos. GRA adicionais também foram detetados (ex: catB3, aacA4-cr, qnrS1, sul1, dfrA14, tet(A) and macA). Alguns dos integrões detetados possuíam vários GRA. Apesar de não ter sido possível obter transconjugantes através de ensaios de conjugação, confirmou-se a presença de plasmídeos conjugativos através da análise genómica. Foram detetados vários fatores de virulência nos genomas sequenciados e os organismos foram previstos como patogénicos para humanos. Com este estudo conclui-se que alguns dos ambientes aquáticos estudados possuem cargas microbianas acima do desejável e que as BRA detetadas possuíam genes de resistência a carbapenemos e a outras classes de antibióticos, habitualmente associados a EGM envolvidos em surtos graves e que podem contribuir para a disseminação de GRA entre diferentes bactérias e ambientes. São necessários estudos posteriores para elucidar a fonte destes GRA e tentar prevenir a sua disseminação, com o objetivo de abrandar a resistência a antibióticos, especialmente a resistência a antibióticos de último recurso.