Studying the role of bacteria in pine wilt disease development

Abstract

Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) is considered an A2 quarantine pest in the European Union and the only recognized causative agent of the pine wilt disease (PWD), a disease affecting pine trees in Europe and Asia with far-reaching economic and environmental impacts. Tree to tree transmission of B. xylophilus depends on its insect-vector of the genus Monochamus (Cerambycidae: Coleoptera). Wilt toxins were found to be produced by nematode-associated bacteria leading to the hypothesis that bacteria might play an important role in the wilt mechanism. Similarly, the insect-vector and the host tree microbiome might be relevant for the disease mechanism. Therefore, the aim of this study is to clarify the role of bacteria in pine wilt disease through the characterization of the bacterial communities’ composition and function associated to the disease players: the nematode, the insect-vector and the tree. To do so, both culture-independent (denaturing gradient gel electrophoresis, massive parallel sequencing and clone libraries) and classic culture-dependent methods were used. Results demonstrated that the disease players (i.e. the nematode, the insectvector and the tree) each has a specific bacterial community, which is influenced by the environmental context. However, a core microbiome was identified, comprising shared bacterial groups mainly of the families Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae. When analysing insect-vectors from different species, the results demonstrated a species-specific microbiome. The bacterial community composition of the nematode in its propagative stage was similar to one from the insect vector, suggesting that it may, in part, be inherited from the insect. In agreement, the Pseudomonas community associated to the nematode and the insect-vector were similar and different from the one associated to the tree. Results showed that Pseudomonas might play a relevant role in disease progression. In silico analyses demonstrated the potential of bacteria associated with the nematode and the insect for xenobiotic degradation and also for tree weakening. It was also possible to establish a collection of endophytic bacterial isolates from trees belonging to three different pine species and to determine their traits regarding plant growth promotion, cell-wall degradation and oxidative stress tolerance. The results suggested the involvement of the pine endophytic community in tree susceptibility to B. xylophilus. The genome of four bacterial endophytic strains detected in the trees trunk were sequenced. From these, two Methylobacterium strains displayed genomic characteristics consistent with a positive interaction with the plant and gave a positive result in Arabidopsis thaliana root elongation assays, suggesting a potential to be used as biological control agents. Overall, this study demonstrated that the PWD results from a multitrophic interaction in which the microbiome associated to the disease is one of the players having a role in disease progression.

Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) é o agente causador da doença da murchidão do pinheiro (DMP) e considerado uma praga na União Europeia. A DMP é uma doença que afeta árvores de pinheiro na Europa e na Ásia, com grande impacto económico e ambiental. A transmissão do nemátode entre árvores é feita por um inseto vetor do género Monochamus (Cerambycidae: Coleoptera). A descoberta da produção de toxinas por parte de bactérias associadas ao nemátode levou a hipótese de que as bactérias podem ter um papel importante no desenvolvimento da DMP. Tal como para o nemátode, também as bactérias associadas ao inseto vetor e à árvore poderão ser relevantes para o desenvolvimento da DMP. Assim sendo, o objetivo do estudo será clarificar o papel das bactérias na DMP através da caracterização da composição e função das comunidades bacterianas associadas aos organismos envolvidos na doença: o nemátode, o inseto vetor e a árvore. Para tal, foram utilizados métodos independentes do cultivo (eletroforese em gel de gradiente desnaturante, sequenciação massiva paralela e construção de bibliotecas de genes) e métodos dependentes do cultivo. Os resultados permitiram identificar um microbioma central da doença ao qual pertencem os grupos bacterianos Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. Foi também identificado um microbioma específico de cada espécie estudada (i.e. nemátode, inseto e pinheiro) e a sua estrutura variou com o local de onde os organismos foram obtidos. A comunidade bacteriana do nemátode na sua fase propagativa mostrou-se mais semelhante à do inseto vetor do que à da árvore, o que sugere que o microbioma do nemátode poderá ser em parte herdado do inseto. A análise da diversidade de Pseudomonas associada aos três organismos corroborou a semelhança entre o microbioma do nemátode e do inseto. Os resultados obtidos mostraram que Pseudomonas poderá ser um grupo bacteriano importante no desenvolvimento da doença. Análises in silico mostraram o potencial das comunidades bacterianas associadas ao nemátode e ao inseto para degradação de xenobióticos e para o enfraquecimento da árvore, como sugerido por outros estudos. Foi ainda possível estabelecer uma coleção de isolados bacterianos endofíticos de três espécies de pinheiro e avaliar a sua capacidade para promoção do crescimento da planta, degradação da parede celular das células vegetais e tolerância a stress oxidativo. Os resultados sugerem que a comunidade endofítica dos pinheiros poderá ter um papel na suscetibilidade da árvore à doença. Os genomas de quatro estirpes bacterianas isoladas do tronco das árvores foram sequenciados, das quais duas estirpes de Methylobacterium, que promoveram o crescimento da raiz em Arabidopsis thaliana, mostraram potencial para serem utilizadas como agentes de controlo biológico. No geral, este estudo mostrou que a DMP resulta de interações multitróficas e que o microbioma associado à doença participa nessas interações sendo importante na progressão da doença.