Regulation of MCL1 3' UTR-APA-derived mRNA isoforms

Abstract

A poliadenilação alternativa (APA) é uma etapa de processamento de pre-mRNA em que isoformas alternativas de mRNA são formadas com base na escolha de um sinal de poliadenilação (pA) sobre o outro. Quando confinada à Região 3’ não-Traduzida (3’ UTR), a APA gera mRNAs que variam somente no comprimento das suas 3’ UTRs (3’UTR-APA). Vários estudos têm demonstrado o papel da APA na regulação da expressão genética. Nos mamíferos, cerca de 70% de genes são sujeitos a APA, aumentando substancialmente a diversidade do transcriptoma. APA é relevante tanto em processos fisiológicos como patológicos, modulando a estabilidade, localização e eficiência da tradução dos transcritos. Trabalhos anteriores do grupo demonstraram que o gene Myeloid Cell Leukemia 1 (MCL1) tem dois sinais de poliadenilação ativos em células T humanas, denominados pA1 e pA2, e que a isoforma pA2 é susceptível à regulação pós-transcripcional pelo miR-17 no citoplasma. O produto proteico comum às duas isoformas de APA – Mcl-1, é um membro anti-apoptótico da família Bcl-2, crucial tanto no câncro como na sobrevivência das células T. Um dos objectivos desta dissertação consistiu em abordar a influência das duas isoformas de APA de MCL1 na localização subcelular de Mcl-1 e em verificar se o miR-17 tem um impacto no seu nível de produção proteica. Deste modo, os seguintes construtos de expressão contendo a sequência codificante de MCL1 (CDS), seguida pela sequência da 3’ UTR curta ou longa, foram transfetados em células HeLa; pEGFP MCL1 CDS pA1, pEGFP MCL1 CDS pA2 e MCL1 CDS pA2ΔmiR17, e a localização de Mcl-1 foi verificada através da microscopia confocal. Pretendíamos ainda otimizar o método da deleção dos sinais pA em células difíceis de transfetar (Jurkat E6.1), através do uso de construtos CRISPR/Cas9 do tipo all-in-one e transdução lentiviral. Para além de planear a criação de linhas com um dos sinais pA de MCL1 deletado: MCL1ΔpA1 e MCL1ΔpA2, respectivamente, o nosso objectivo consistiu em criar linhas estáveis knock-out (KO) para ambos alelos em dois genes envolvidos no processamento de RNA: INTS9 e CPSF1, para estudar a sua função na APA e na expressão de MCL1. Os ensaios de localização mostraram que Mcl-1 derivado da isoforma pA1 é predominantemente expresso na mitocôndria, enquanto Mcl-1 derivado da isoforma pA2 tem uma localização ubíqua. Além disso, a quantificação da intensidade de EGFP mostrou que a isoforma pA1 produz ~ 3 vezes mais proteína que a pA2 e que o miR-17 não é responsável pela baixa expressão de Mcl-1. Por outro lado, a genotipagem das populações de E6.1 submetidas a CRISPR/Cas9 revelou deleções em alelos de quase todas as condições. De seguida, a heterozigotia foi detectada em clones isolados por single-cell sorting. Em conclusão, os estudos de localização provam que a regulação da expressão genética mediada pela 3’ UTR modula tanto o destino como a distribuição subcelular proteica. As abordagens CRISPR/Cas9 foram bem-sucedidas, contudo, a homozigotia ainda está por alcançar, para permitir a realização de ensaios funcionais. Em suma, estes resultados ajudam a esclarecer a regulação de isoformas de mRNA derivadas de 3’ UTR-APA de MCL1, proporcionando-nos oportunidades para aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos e os fatores moleculares subjacentes.

Alternative polyadenylation (APA) is a pre-mRNA processing step in which mRNA isoforms with alternative 3’ ends are formed based on the choice of one polyadenylation (pA) signal over the other. When confined to the 3’ Untranslated Region (3’ UTR), APA generates mRNAs varying only in the length of their 3’ UTRs (3’UTR-APA). Various studies have demonstrated a role for APA in regulating about 70% of mammalian genes, increasing immensely the transcriptome diversity. APA is relevant in both physiological and pathological processes, primarily by modulating transcripts stability, localization and translational efficiency. From our group previous work, it was shown that the Myeloid Cell Leukemia 1 (MCL1) gene has two active pA signals in human T cells that were named pA1 and pA2 and that the pA2 isoform is susceptible to post-transcriptional regulation by miR-17 in the cytoplasm. The APA isoforms common protein product –Mcl-1, is an anti-apoptotic member of the Bcl-2 protein family, crucial in both cancer and T cell survival. One of the aims of this thesis consisted in assessing the influence of the two MCL1APA isoforms on subcellular distribution of Mcl-1 and verify if miR-17 has an impact on Mcl-1 protein production. In order to do so, the following expression constructs featuring MCL1 coding sequence (CDS) followed by either the short or the long 3’ UTR sequence were transfected in HeLa cells; pEGFP MCL1 CDS pA1, pEGFP MCL1 CDS pA2 and MCL 1 CDS pA2∆miR17, and Mcl-1 localization was verified by live-cell confocal microscopy. In addition, we aimed to optimize a method for pA signal deletion in difficult to transfect cells (Jurkat E6.1), by using all-in-one CRISPR/Cas9 constructs and lentiviral transduction. Aside from planning to generate MCL1 lacking either the proximal (MCL1∆pA1) or the distal (MCL1∆pA2) signal, it was our objective to generate stable E6.1 double-allele knock-outs (KO) for two RNA processing-involved genes: INTS9 and CPSF1 and assess their effect on MCL1APA. The localization assays showed that the pA1 isoform-derived Mcl-1 was predominantly expressed in the mitochondria while the pA2/ pA2∆miR17 isoforms-derived Mcl-1 had a ubiquitous localization. Furthermore, the quantification of EGFP intensity showed that the pA1 isoform produced ~3-fold more protein than pA2, and that miR-17 was not responsible for pA2 isoform-derived Mcl-1 low expression. On the other hand, genotyping of RISPR/Cas9-subjected bulk E6.1 populations has rendered deletion-positive alleles in almost all conditions. Then, heterozygosity was detected in single-cell sorting isolated clones. In conclusion, the localization studies prove that the 3’ UTR-mediated regulation of gene expression reaches into protein fate modulation, like subcellular distribution. The CRISPR/Cas9 approaches have been successful, but homozygosity is yet to be reached, to allow conducting functional assays. Overall, these results shed light on MCL1 3’ UTR-APA-derived mRNA isoforms regulation, providing us with opportunities to delve deeper into its subjacent mechanisms and molecular players.