Filmes de colagénio eletricamente estimulados para crescimento de tecidos

Abstract

Ao longo dos últimos anos tem- se tornado evidente que em alguns casos os biomateriais devem ser mais do que meros suportes temporários para o crescimento de novos tecidos, podendo intervir ativamente no processo de regeneração. O facto de o fenómeno piezoelétrico estar associado à reparação óssea, foi uma das principais motivações para a procura de materiais com características piezoelétricas, como potenciais indutores da regeneração de tecidos. Deste modo, os materiais piezoelétricos têm captado, nos últimos anos, a atenção dos investigadores, para a medicina regenerativa. O objetivo deste trabalho foi a preparação, caracterização e investigação do efeito da polarização dos filmes de colagénio tipo I na morfologia e adesão das células hOB e MG-63. O colagénio tipo I foi o material piezoelétrico escolhido para a realização deste trabalho, uma vez que, para além de ser a principal proteína constituinte do organismo humano, se pensa que as suas propriedades piezoelétricas estejam envolvidas na autorreparação óssea. Foram preparados filmes de colagénio tipo I pelo método de drop-casting tendo sido posteriormente polarizados a 40 ºC pelo método da descarga de Corona, carregando desta forma os filmes positiva e negativamente. Para uma melhor análise dos filmes obtidos foram realizadas primeiramente caracterizações aos filmes relativamente à sua morfologia, estrutura, rugosidade e comportamento térmico, tendo posteriormente sido analisados filmes sem submissão à polarização e filmes polarizados, relativamente à sua molhabilidade e composição estrutural com o principal objetivo de analisar se existe alguma alteração induzida pela polarização dos mesmos. Estes estudos foram seguidos dos estudos celulares preliminares por recurso a duas linhas celulares: as hOB que são células osteoblásticas humanas e as MG-63, uma linha tumoral proveniente de osteossarcomas. Os filmes de colagénio, com uma espessura aproximada de 2 μm, revelam rugosidades micrométricas, geralmente favoráveis às atividades celulares, com rugosidades médias de 111 ± 20 nm. A análise térmica evidencia um pico endotérmico largo aos aproximadamente 62 ºC, indicando a existência de moléculas com estabilidades/ comportamentos térmicos diferentes. As medidas de ângulos de contacto revelaram que todas as superfícies analisadas se encontram no domínio hidrofílicos, tendo-se no entanto registado melhorias na molhabilidade dos filmes de colagénio submetidos à polarização. A análise da composição estrutural através da Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) mostrou a presença das bandas típicas para o colagénio tipo I, tendo sido detetada a amida A, I,II e III, para todos os grupos de filmes analisados. Nos estudos celulares preliminares realizados verificou-se que para ambas as linhas celulares (hOB e MG-63), as células em contacto com as superfícies polarizadas apresentam um maior número de filamentos de F-actina bem orientados, o que indica a existência de uma forte interação das células com este tipo de superfície. As contagens celulares apontam para uma preferência das hOB relativamente aos filmes de colagénio (-), enquanto que, não foram detetadas diferenças significativas na adesão celular para nenhum dos grupos de filmes analisados para o caso da linha celular MG-63.

Over the past few years it has become apparent that in some cases the biomaterials should be more than temporary supports for the growth of new tissues and must intervene actively during the regeneration process. The discovery of piezoelectricity and their involvement on the repair process in biological tissues, such us, skin, tendon and bone, has led to the idea of using unique materials, such as materials that exhibit surface charges, as potential inducers for regenerative medicine. The aim of this study lays on the preparation, characterization and subsequent analysis of the influence that polarization of type I collagen films has on cell morphology and adhesion. Type I collagen is the piezoelectric material selected for this work because besides being the most abundant protein in the body that plays a fundamental role in tissues and organs formation, it is thought that the piezoelectric properties of this protein could be related to the ability of bone self-repair. For this purpose collagen films were prepared by dop-casting method and subsequently macroscopically polarized at 40 ° C by Corona poling. In that way there were produced negatively and positively charged films. For a better understanding of the obtained films there were done characterizations regarding their morphology, structure, roughness and thermal behavior. Subsequently polarized and non-polarized films were analyzed in relation to their wettability and chemical composition with the main goal to detect possible changes induced by polarization. Preliminary cellular studies were conducted with two cell lines: a human osteoblastic cell type (hOB) and an osteosarcoma cell line (MG-63). The obtained collagen films have a thickness of approximately 2 μm. The surface roughness measurements of the films show a micrometric roughness that generally is promising for cellular activities. The average roughness that was obtained is around 111 ± 20 nm. Thermal analyses show a broad endotherm peak at approximately 62 ° C representing a variability of molecules with different thermal stabilities. The contact angle measurements have shown that all analyzed surfaces are in the hydrophilic domain. However it was shown a significant improvement of the wettability for the polarized collagen films. Results of Fourier Transform InfraRed Spectroscopy (FTIR) analyses indicate the presence of the typical peaks for collagen type I FTIR spectra. It was detected the characteristic bands of amide A, I, II and III for all analyzed film groups. In preliminary cellular studies it was found that for both cell lines (hOB and MG-63) the cells in contact with the polarized surfaces spread with cytoskeletal rearrangements of actin filaments being observed through the formation of stress fibers, which indicates the existence of a strong interaction between the cell and the charged surfaces. The cell counting indicates that the hOB cells prefer the negatively charged collagen films (-) while for the cell line MG-63 no significant differences were detected in cell adhesion between any of the analyzed films groups.