Isolation and characterization of PHAs-accumulating bacteria from HSSL

Abstract

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biodegradable and biocompatible biopolymers. PHAs emerge as a possible solution as substitutes of petroleum based plastics, being produced under the Biorefinery concept, in which wastes and by-products of numerous industries may be used as carbon source. This project aimed the isolation and characterization of organisms able to store PHAs from Hardwood Sulphite Spent Liquor (HSSL), a by-product of the pulp and paper industry. Isolation was performed from a Mixed Microbial Culture (MMC) selected under feast and famine conditions, using some components present in HSSL as substrates, such as acetic acid and xylose. Five pure isolates able to produce PHAs resulted from the successive streaking in solid medium containing HSSL. The purity of the isolates was evaluated through Gram staining and FISH analysis and the PHAs accumulation by Nile Blue staining. Two strains were identified as Rhohococcus spp. and three as Pseudomonas spp.. One isolate of each genus was selected and further studied in terms of growth and PHAs accumulation capability from three distinct carbon sources (HSSL, acetic acid and xylose). Both isolates, Rhodococcus spp. and Pseudomonas spp., were able to grow and use the three carbon sources as well as to produce PHAs. However, both strains showed a higher maximum specific growth rate (μmax) when HSSL was used as carbon source, 0.212 ± 0.0219 h-1 and 0.251 ± 0.0526 h-1, respectively. A qualitative evaluation of the PHAs accumulation through Nile Blue staining exhibited a higher accumulation when acetic acid was used as sole carbon source. In an attempt to identify some of the species responsible for PHAs accumulation of the selected MMC, belonging to the dominant class, Alphaproteobacteria, a 16S rDNA clone library was constructed. It was possible to identity Novosphingobium spp., Sphingobium spp. and Pleomorphomonas spp.

Polihidroxialcanoatos (PHAs) são biopolímeros biodegradáveis e biocompatíveis. Os PHAs são considerados uma solução possível como substitutos dos plásticos derivados do petróleo, podendo ser produzidos no âmbito do conceito de Biorefinaria utilizando resíduos como fonte de carbono. Este trabalho teve como objectivo o isolamento e a caracterização de bactérias produtoras de PHAs a partir de licor de cozimento ao sulfito ácido (HSSL), um sub-produto da indústria papeleira. Os isolamentos foram realizados partindo de uma cultura mista seleccionada para a acumulação de PHAs por imposição de ciclos de fome e fartura, utilizando alguns dos componentes do HSSL como substrato, nomeadamente a xilose e o ácido acético. Após repicagens sucessivas em meio sólido contendo HSSL, foi possível obter cinco isolados puros capazes de acumular PHAs. A pureza dos isolados foi avaliada através de coloração de Gram e análise FISH e a capacidade de acumulação de PHAs por coloração de Azul do Nilo. Duas estirpes foram identificadas como Rhohococcus spp. e três como Pseudomonas spp.. Um isolado de cada género foi seleccionado e estudado em termos de crescimento e capacidade de acumulação de PHAs, a partir de três fontes de carbono distintas (HSSL, ácido acético e xilose). Verificou-se que ambos os isolados, Rhodococcus spp. e Pseudomonas spp., foram capzes de crescer nos três meios e produziram PHAs. Contudo, ambas as estirpe apresentaram uma taxa específica de crescimento (μmax) superior com HSSL como fonte de carbono, 0.212 ± 0.0219h-1 e 0.251 ± 0.0526h-1 respectivamente. Uma avaliação qualitativa da acumulação de PHAs utilizando coloração Azul do Nilo mostrou uma acumulação maior nos ensaios em que o ácido acético era a única fonte de carbono. Numa tentativa de identificar algumas das espécies responsáveis pela acumulação de PHAs da cultura mista seleccionada pertencentes à classe dominante, Alfaproteobactéria, recorreu-se à construção de uma biblioteca de clones 16S rDNA. Foram identificadas as espécies Novosphingobium spp., Sphingobium spp e Pleomorphomonas spp.