Mitochondrial defects in proteasome and COP9 mutants

Abstract

The aim of this work is the study of phenotypic changes and mitochondrial morphology in Saccharomyces cerevisiae cells with specific mutations in genes involved in the ubiquitin-proteasome pathway. The protein turnover is important because it ensures organelles viability such as mitochondria, indispensable for cell survival. The COP9 complex is paralogous to the proteasome lid and eukaryotic translational initiator factor 3 (eIF3) complexes. The CSN5 subunit of the COP9 signalosome is responsible for the E3 ligase Cdc53/Cul1 activity through the removal of the ubiquitin-like protein, Rub1. Deletion of the Csn5 gene is lethal in high eukaryotes but not in yeast, this observation allow us to study the effects of this mutation in this organism (strain Δcsn5) together with other mutants or double mutants: rpn11-m1, Δrub1, rpn11-m1/Δcsn5 rpn11-m1/ Δrub1. Mutants and wildtype (W303-1A) were characterised regarding growth in different carbon sources and temperature as well as response to stress or DNA damage causing agents (methyl methanesulfonate and canavanin). The morphological results allowed us to investigate authophagy, and in particular mitophagy, through fluorescence microscopy (GFP-Atg8 and GFP-Atg32) and Western Blot analysis. We found a relation between deubiquitination undertaken by Rpn11 protein, from the 19S proteasome subunit, and the activation of rubylation/derubylation cycles by the CSN5 subunit of the CSN complex (COP9 signalosome). In fact, the rpn11-m1/ Δrub1 shows a semi-lethal phenotype and mitophagy in exponential phase in glucose rich medium. Also the Δcsn5 strain shows early mitophagy together with phenotypic changes, such as big vacuoles. In addition, it has been established a possible relationship between the CSN complex and the resilience to damage in the DNA caused by the methylating agent, methyl methanesulfonate (MMS).

O objectivo deste trabalho centrou-se no estudo das alterações fenotípicas e ao nível da morfologia mitocondrial em células de levedura Saccharomyces cerevisiae com mutações específicas em genes envolvidos na via de degradação proteica ubiquitinaproteasoma. O turnover proteíco é muito importante pois garante a viabilidade dos vários organelos celulares, de entre os quais, a mitochondria, cuja função principal é a produção de energia na forma de ATP. A subunidade Csn5 do COP9 signalosome, complexo com elevada similaridade com a lid proteasomal e com o factor 3 de iniciação translacional em eucariotas (eIF3), é responsável pela actividade da E3 ligase Cdc53/Cul1 através da remoção da proteina similar à ubiquitina, Rub1. A delação do gene que codifica para a subunidade Csn5 é letal em eucariotas superiores mas não em levedura o que nos permite estudar os seus efeitos juntamente com outros mutantes: rpn11-m1, Δrub1, rpn11-m1/Δcsn5 rpn11-m1/ Δrub1. Mutantes e wild-type (W303-1A) foram caracterizados a nível de crescimento em diferentes fontes de carbono e a diferentes temperaturas, assim como à resposta a factores causadores de dano ao nível do DNA e síntese proteica (sulfonato de metil metano e canavanina) juntamente com uma análise do potencial de membrana mitochondrial, autofagia/mitofagia através de microscopia de fluorescencia (GFP-Atg8 e GFP-Atg32) e Western Blot. Os resultados obtidos indicam que existe uma relação entre a acção de deubiquitinação da proteina Rpn11, da subunidade 19S do proteasome, e a activação dos ciclos de rubilação/ derubilação pela subunidade Csn5 do complex CSN (COP9 signalosome), sendo que o mutante rpn11-m1/Δrub1 apresenta um fenótipo semi-letal com instabilidade ao nível do DNA e alterações mitocôndriais que levam a um mitofagia em fase exponencial em meio rico em glucose. Por sua vez, o mutante rpn11-m1/Δcsn5 também revela mitofagia prematura em conjunto com alterações fenotípicas, como o aumento da dimensão celular (grande vacúolo), que ja é também evidente no mutante Δcsn5. Foi ainda estabelecida uma possível relação entre o complex CSN e a capacidade de resistência aos danos causados no DNA pelo agente metilante MMS.