Establishing stem cell based systems to study neuropathologies

Abstract

As células estaminais distinguem-se dos outros tipos de células pela sua capacidade de auto-regeneraração e simultaneamente diferenciação em diferentes tipos celulares. Estas células dividem-se em duas categorias: células estaminais embrionárias e somáticas. As que se enquadram no primeiro grupo originam todos os tipos celulares de um determinado organismo (pluripotentes), enquanto as células estaminais somáticas originam apenas alguns tipos celulares (multipotentes). Atualmente, células diferenciadas podem no entanto ser geneticamente reprogramadas para um estado indiferenciado através da indução de expressão de genes específicos que estão altamente expressos em células estaminais embrionárias (células estaminais de pluripotência induzida). A possibilidade de estudar neuropatologias utilizando modelos baseados em células estaminais tem sido amplamente explorada nos últimos anos. Como tal, os principais objetivos desta dissertação foram o isolamento e proliferação de células estaminais da mucosa olfativa e a sua posterior diferenciação em células derivadas de neuroesferas olfativas (ONS) e células tipo neuronal (NLC). A caracterização do sistema modelo ONS foi igualmente realizada. Sequencialmente, foram utilizadas duas enzimas (Dispase e Colagenase) para isolar as células estaminais da mucosa olfativa. Células estaminais da lâmina própria e do epitélio da mucosa olfativa foram isoladas e proliferaram no meio DMEM/F12. Ambos os tecidos foram diferenciados em neuroesferas (utilizando meio DMEM/F12 suplementado com ITS-X, EGF e FGF2) e posteriormente em células derivadas de neuroesferas olfativas (utilizando meio DMEM/F12 suplementado com FBS) e em células tipo neuronal (usando meio neurobasal suplementado com B27, glutamina e glutamato). Os nossos resultados indicam que estabelecemos com sucesso culturas primárias de células estaminais olfativas a partir da mucosa olfativa de rato. A eficiência dos processos de isolamento e proliferação foi comprovada pela presença do marcador de estaminalidade nestina. A diferenciação das células estaminais em células derivadas de neuroesferas olfactivas (ONS) também for realizada com sucesso. A caracterização bioquímica dessas células revelou que, relativamente aos níveis de expressão da proteína precursora de amiloide de Alzheimer (PPA) e da proteína Tau, o sistema modelo em estudo apresenta resultados semelhantes aos obtidos com alguns sistemas modelo do tipo neuronal previamente caracterizados, nomeadamente as linhas celulares PC12 e SH-SY5Y. No entanto uma caracterização mais pormenorizada deve ser realizada. Os resultados obtidos fortalecem a hipótese de este modelo poder vir a ser utilizado para estudo dos mecanismos moleculares subjacentes a diversas neuropatologias, como a doença de Alzheimer.

Stem cells are distinguished from other cell types by their ability to both selfrenew and to differentiate into a diverse array of specialized cell types. Naturally occurring stem cells are divided into two categories: embryonic stem cells and somatic stem cells. While embryonic stem cells are able to generate all the differentiated cells of the developing soma (pluripotent stem cells), somatic stem cells assume increasing degrees of fate restriction as they specialize into specific tissue lineages (multipotent stem cells). Specialized cells can also be genetically reprogrammed to a stem cell-like state through the induced expression of key genes that are highly expressed in embryonic stem cells. The possibility to investigate neuropathologies using stem cells based systems has been widely explored in the last years. Therefore the main objectives of this dissertation were isolation and proliferation of olfactory mucosa stem cells that were further differentiated in olfactory neurospheres derived cells (ONS) and neuron-like cells (NLC). Characterization of the ONS model system was also performed. We sequentially used Dispase and Collagenase to isolate olfactory mucosa stem cells that further proliferate in DMEM/F12 medium. The stem cells of either lamina propria and epithelium of olfactory mucosa were isolated and proliferated. Both tissues were further differentiated in neurospheres (using DMEM/F12 supplemented with ITS-X, EGF and FGF2), and finally in olfactory neurospheres-derived cells (using DMEM/F12 medium) and neuron-like cells (using neurobasal medium supplemented with B27, glutamine and glutamate). Our results indicate that we successfully established primary cultures of olfactory stem cells from rat olfactory mucosa. The efficiency of the isolation/proliferation procedure was accomplished by positive immunostaining using the stemness marker nestin. The differentiation of the olfactory stem cells into olfactory neurospheres derived cells (ONS) was also effective. The preliminary morphological and biochemical characterization of the ONS models system was achieved and revealed that our ONS model system in term of APP and Tau expression levels behaves similarly to neuronal-like model systems previously characterized including PC12 and SHSY5Y cell lines. However, additional characterization should also be performed. Our results strength the hypothesis of using stem cells based model systems to study the cellular and molecular mechanisms underlying several neuropathologies, including Alzheimer’s disease.