Study of the Cd complexation mechanism by glutathione in Rhizobium leguminosarum

Abstract

A associação simbiótica de plantas leguminosas com bactérias do género Rhizobium é o maior e mais eficiente contribuinte de azoto fixado biologicamente (Somasegaran e Hoben, 1994; Zahran, 1999). No entanto, o constante aumento da poluição em solos agrícolas, nomeadamente a contaminação por metais devido à aplicação de fertilizantes e de lamas, está a tornar-se um problema ambiental cada vez mais preocupante (Alloway, 1995a; Giller et al., 1998; Permina et al., 2006; Thorsen et al., 2009; Wani et al., 2008), influenciando de forma negativa a persistência destas bactérias nos solos agrícolas, assim como a sua eficácia de nodulação (Broos et al., 2005; Wani et al., 2008;. Zhengwei et al., 2005). Desta forma, o estudo dos mecanismos de tolerância de Rhizobium a metais tornou-se uma área de investigação de elevada importância. Com o trabalho apresentado nesta tese pretendeu-se perceber melhor a tolerância Rhizobium leguminosarum ao cádmio (Cd), dando particular atenção a um mecanismo de tolerância previamente descrito em R. leguminosarum (Lima et al., 2006): a complexação intracelular de Cd pelo tripéptido glutationa (GSH). Assim, o principal objectivo deste trabalho foi perceber melhor qual a importância deste mecanismo nos níveis de tolerância de rizóbio ao Cd. Como já tinha sido descrito em trabalhos anteriores (Figueira et al., 2005; Lima et al., 2006), foi possível verificar que a estirpe mais tolerante ao metal apresenta níveis mais elevados de Cd e GSH intracelulares. Demonstrou-se ainda que a tolerância ao Cd está dependente da maior eficiência no mecanismo de complexação observada na estirpe tolerante, logo durante as primeiras 12 h de crescimento. Gomes et al. (2002) verificou que a acumulação de complexos GSH-Cd no citoplasma inibe a entrada de metal na célula. Como neste trabalho se observou um aumento nos níveis de Cd intracelular na estirpe tolerante ao longo do tempo, surgiu a hipótese dos complexos serem excretados para o espaço periplasmático. Os elevados níveis de GSH e de Cd determinados no espaço periplasmático corroboraram esta hipótese. Neste trabalho demonstrou-se ainda que a eficácia do mecanismo de complexação, depende da actividade enzimática de uma isoforma específica de GST, que apresentou um elevado acréscimo de actividade na presença do metal. Desta forma, os resultados desta tese indicam que, a maior tolerância de R. leguminosarum ao Cd, depende da capacidade das estirpes para induzir a síntese de GSH na presença de Cd e, simultaneamente aumentar a actividade enzimática da GST específica, optimizando assim o mecanismo de complexação de Cd intracelular.

The symbiotic association of leguminous plants and rhizobia also has a crucial impact on the nitrogen cycle: estimates are that rhizobial symbioses, with a number greater than 100 important agronomical legumes, contribute nearly half to the annual quantity of nitrogen fixed biologically entering soil ecosystems (Somasegaran and Hoben, 1994; Zahran, 1999). Nevertheless, the permanent increased of metal pollution in agriculture soils, due to the current use of fertilizers and industrial and domestic sludge, is becoming one of the most troublesome environmental problems (Alloway, 1995a; Giller et al., 1998; Permina et al., 2006; Thorsen et al., 2009; Wani et al., 2008), has a negative impact in rhizobia persistence in agricultural soils and its ability to form nitrogen-fixing nodules (Broos et al., 2005; Wani et al., 2008; Zhengwei et al., 2005). So, the study of the tolerance mechanisms of soil bacteria to metals arises as a research area with great importance. In this thesis it was intended to draw attention to the tolerance to Cd of Rhizobium leguminosarum, a specific soil bacteria that establish symbiotic associations with legumes. The present study focused on a particular strategy that Rhizobium leguminosarum possess to tolerate Cd: the intracellular chelation of Cd by the tripetide GSH. Thus the elucidation of the role of GSH as a metal chelating agent in bacteria tolerance to Cd was considered to be the main aim of this work. Higher intracellular Cd and GSH levels were observed in the tolerant strain as it had already been demonstrated by others authors (Figueira et al., 2005; Lima et al., 2006). It was also demonstrated that Rhizobium leguminosarum tolerance to Cd was dependent on the higher efficiency of the chelation mechanism exhibited by the tolerant strain. This mechanism was activated at the beginning of the lag phase (12 h of growth). As the accumulation of GSH-Cd complexes may inhibit intracellular Cd uptake (Gomes et al., 2002), which was not observed in the tolerant strain, the GSHCd complexes were suggested to be transported into the periplasmic space. The results point out this hypothesis as the most viable as high levels of GSH and Cd were found in the periplasmic space but only a small percentage of GSH-Cd complexes were quantified. It was also established that the chelation mechanism occurred in the cytoplasm, and its efficiency appeared to be dependent on the enzymatic activity of a specific GST isoform. So, the ability of the tolerant strain to induce GSH synthesis under Cd exposure and, simultaneously, to increment the activity of a specific GST was point out as the main reasons behind the differences the tolerance to Cd observed between the two strains.