Generational transmission of pro- /anti-genotoxic alterations induced by pesticides

Abstract

The DNA damage may result in mutations, leading to malignant transformation (in somatic cells) and/or having the potential to cause altered heritable traits (if it occurs in gametes). Therefore, the real impact of agrochemicals through genotoxicity can be thoroughly assessed only if the understanding on how a parental exposure is translated into the offspring is achieved, predicting the repercussion on the prole. In the same direction, there is a need to unveil the ability of damage reversion after the exposure cessation, enabling a better forecast of the consequences both at the present and subsequent generations. In addition, it is critical to clarify in what extent this potential impact of agrochemicals can be modulated by the organism physiological state and surrounding environmental conditions. The levels of pesticides in water have increased worldwide due to their intensive use and/or misuse in the modern agricultural domain. Many components of pesticide formulations are stable over time and can be transported in water and air far from their point source. Consequently, the use of these agents has affected several ecosystems, threatening non-target organisms. In particular, aquatic biota can be exposed to waterborne pesticides, generating health risks at several levels, with emphasis on genomic instability. In addition to the impact on DNA integrity, several studies have shown that pesticides can have an epigenotoxic impact. It is known that epigenetic changes can be transmitted by mitosis and meiosis, which means that these modifications can be maintained throughout the organism's life and transported to the next generation. Moreover, since each generation might be affected by multiple exposures to pesticides, the knowledge about the induced alterations, as well as their intergenerational transmission, is crucial to understand the phenomena of acquired vulnerability or resistance as key determinants to the real impact on the population. Procambarus clarkii, the red swamp crayfish, is a native species to the southern United States and north-eastern Mexico, though, nowadays, can be found in inland waters on all continents except Australia and Antarctica. This crayfish is seen as a paradigm of success due to its ecological plasticity, showing high resistance in adverse conditions (e.g., pesticide contamination scenarios). Thus, and considering its wide distribution, this crayfish was selected as a “tool organism” to perform the current ecogenotoxicological study. Bearing all this in mind, this biphasic work aimed (i) to assess the DNA damaging potential of the herbicides glyphosate and penoxsulam, the insecticides dimethoate and imidacloprid, and the fungicides pyrimethanil and imazalil (Phase 1). In a 2ⁿᵈ phase, it was aimed: (ii) to evaluate the penoxsulam long-term genotoxicity; (iii) to increase the knowledge concerning the effects of parental exposures on offspring, considering methylome and DNA integrity; (iv) to contribute to the implementation of the pesticidovigilance concept. Within phase 1, it was first assessed the short-term (7 days) spermiotoxic potential of the above-mentioned pesticides, at environmentally relevant concentrations (i.e., glyphosate at 9 and 90 μg L⁻¹, penoxsulam at 2.3 and 23 μg L⁻¹, dimethoate at 2.4 and 24 μg L⁻¹, imidacloprid at 13.1 and 131 μg L⁻¹, pyrimethanil at 2.2 and 22 μg L⁻¹, and imazalil at 16 and 160 μg L⁻¹), through an ex vivo approach. Sperm DNA integrity was affected by the higher concentrations of glyphosate, pyrimethanil and imazalil, as well as by both concentrations of penoxsulam and dimethoate. Imidacloprid was the only pesticide (insecticide) displaying pro-oxidant properties, despite the absence of non-specific DNA damage. This (first) phase also demonstrated the suitability of the ex vivo approach to spermiotoxicity screening, highlighting the impact of pesticides on non-target species, such as P. clarkii, due to the critical role of sperm DNA integrity on the population’s success. Since penoxsulam showed to be the most spermiotoxic pesticide, it was then elected to perform phase 2. Assuming that harmful effects of environmental noxious compounds can be extended beyond the exposure time scale, phase 2 began with the evaluation of the genetic damage progression following an exposure (7 days) to penoxsulam (Px: 23 μg L⁻¹) and a post-exposure period (70 days), considering crayfish somatic and germ cells. The same approach was applied to the model genotoxicant ethyl methanesulfonate (EMS; 5 mg L⁻¹), as a complementary path to improve the knowledge concerning the genotoxicity dynamics (DNA damage induction vs. recovery). The outcomes of this stage of work pointed out Px genotoxicity in all cells/organs tested (i.e., gills, hepatopancreas and spermatozoa), also disclosing cells- and gender-specificities, with gill cells showing to be more vulnerable in females, while males demonstrated higher susceptibility when internal cells/organs (i.e., hepatopancreas and spermatozoa) were considered. Regarding the model genotoxicant, crayfish were unable to recover from the DNA damage induced by EMS in gills and hepatopancreas (both genders), as well as in spermatozoa. Male gametes proved to be the most vulnerable cell type, while DNA damage in hepatopancreas was only perceptible after the post-exposure period. Thus, it became clear that the characterization of the genotoxic hazard of a given agent must integrate a complete set of information, addressing different types of DNA damage, cell/organ- and gender-specificities, as well as a long-term appraisal of the temporal progression of damage. The supposition that the long-term damage caused by Px went beyond the exposed generation was confirmed by the effects on methylome and sperm DNA currently reported in the prole, following a parental exposure. Therefore, considering an intergenerational context and the demonstration of the Px genotoxic potential, two steps followed (within the above-mentioned phase 2). The first one consisted in the understanding of the action of Px on methylome of skeletal muscle cells in two crayfish generations. Thus, F0 and its progeny (F1) were exposed to Px (23 μg L⁻¹) and to EMS (5 mg L⁻¹). Adult crayfish (F0) didn’t present alterations in the methylome following the herbicide exposure. However, the hypomethylation occurring in unexposed F1 juveniles (with parental exposure to Px) demonstrated that the history of exposure, per se, can modulate the epigenome, pointing out an intergenerational epigenetic effect. In F1 descendants of the Px-exposed group, hypermethylation was more pronounced in males than females. Moreover, EMS induced hypomethylation in adult females (F0), highlighting a gender-specificity. The modulatory role of past (parental) exposures to penoxsulam or EMS showed also to depend on the offspring developmental stage. These outcomes proved that an indirect influence (i.e., exposure events occurring in the preceding generation) can have a higher impact on epigenetic dynamics than direct exposures. The second step included indirect exposures, adopting an ex vivo approach, where the DNA integrity of F1 spermatozoa was evaluated following a Px or EMS exposure, with and without the influence of a parental exposure (F0) to the same compounds. The parental exposure, alone, did not affect the DNA integrity of F1 spermatozoa (unexposed). However, the historical of a Px exposure increased the vulnerability to oxidative DNA lesions in the Px-exposed offspring. The descendants from the generation exposed to EMS seemed to develop DNA protection mechanisms expressed when they were also exposed to this specific genotoxic challenge, unveiling protective traits arising from the parental history, disclosing it as a toxicological shield. The spermiotoxic potential of Px was only observed with a parental exposure background to EMS, disclosing, this time, life history (Px-exposure) as a toxicological “shadow” (negative traits) to progeny. Overall, the present findings demonstrated that the recommendations of regulatory procedures for aquatic environment protection must be improved. Therefore, the current research pointed out the importance of performing an (epi)genotoxic evaluation (combining two useful biomarkers, namely DNA integrity and DNA methylation) encompassing several generations. Moreover, during pesticide marketing authorization, it should be considered a continuous evaluation of these agents in order to determine their real environmental impact, which can be regarded as a call for pesticidovigilance.

O dano no ADN pode resultar em mutações, causando transformações malignas (em células somáticas) e/ou com potencial para originar alterações herdáveis (se ocorrer em gametas). Portanto, o impacto real dos pesticidas, através da genotoxicidade, só pode ser rigorosamente avaliado se for alcançado o entendimento da forma como uma exposição parental se traduz na prole, prevendo a repercussão na mesma. Nesse sentido, há a necessidade de perceber a capacidade de reversão do dano após a cessação da exposição, possibilitando uma melhor previsão das consequências, tanto na geração presente como nas subsequentes. Para além disso, é fundamental esclarecer em que medida o impacto dos pesticidas pode ser modulado pelo estado fisiológico do organismo, assim como, pelas condições ambientais. Os níveis de pesticidas nos sistemas aquáticos aumentaram em todo o mundo devido ao seu uso intensivo e/ou indevido, nas práticas agrícolas. Muitos dos componentes das formulações comerciais de pesticidas são estáveis ao longo do tempo e podem ser transportados na água e no ar para áreas distantes de sua fonte de emissão. Consequentemente, o uso destes agentes tem afetado diversos ecossistemas, ameaçando organismos não-alvo. Em particular, o biota aquático pode ser exposto a agrotóxicos, gerando riscos a diversos níveis, com destaque para a instabilidade no ADN. Para além do impacto na integridade do ADN, vários estudos mostraram que os pesticidas podem ter um impacto a nível epigenético. Sabe-se que as alterações epigenéticas podem ser transmitidas por mitose e meiose, o que significa que essas modificações podem ser mantidas ao longo da vida do organismo e transpostas para a geração seguinte. Além disso, uma vez que uma dada geração pode ser afetada por múltiplas exposições a pesticidas, o conhecimento sobre as alterações induzidas, bem como a sua transmissão intergeracional, é crucial para entender os fenómenos de vulnerabilidade ou resistência adquiridos, como elementos-chave do impacto real na população. O Procambarus clarkii, também conhecido como o lagostim vermelho do Louisiana, é uma espécie nativa do sul dos Estados Unidos e nordeste do México, embora, atualmente, possa ser encontrado em águas fluviais em todos os continentes, exceto na Austrália e na Antártida. O lagostim vermelho é visto como um paradigma de sucesso devido à sua plasticidade ecológica, apresentando alta resistência em condições adversas (por exemplo, cenários de contaminação por pesticidas). Assim, e considerando a sua ampla distribuição, este lagostim foi selecionado como “organismo-teste” para a realização do presente estudo ecogenotoxicológico. Partindo dos anteriores pressupostos, este trabalho, dividido em 2 fases, teve como objetivo na 1ª fase (i) avaliar o potencial para induzir dano no ADN dos herbicidas glifosato e penoxsulame, dos inseticidas dimetoato e imidaclopride e dos fungicidas pirimetanil e imazalil, numa exposição de curto prazo. A 2ª fase teve como objetivos: (ii) avaliar a genotoxicidade do penoxsulame a longo prazo; (iii) aumentar o conhecimento sobre os efeitos das exposições parentais, considerando a integridade do metiloma e do ADN na prole; (iv) contribuir para a implementação do conceito de pesticidovigilância. Na 1ª fase, começou-se por avaliar o potencial espermiotóxico dos pesticidas acima mencionados, no curto prazo, em concentrações ambientalmente relevantes (ou seja, glifosato 9 e 90 μg L⁻¹, penoxsulame 2,3 e 23 μg L⁻¹, dimetoato 2,4 e 24 μg L⁻¹, imidaclopride 13,1 e 131 μg L⁻¹, pirimetanil 2,2 e 22 μg L⁻¹ e imazalil 16 e 160 μg L⁻¹), através de uma abordagem ex vivo. A integridade do ADN nos espermatozoides foi afetada pelas concentrações mais elevadas de glifosato, pirimetanil e imazalil, bem como por ambas as concentrações de penoxsulame e dimetoato. O imidaclopride foi o único pesticida (inseticida) que apresentou propriedades pró-oxidantes, apesar da ausência de danos inespecíficos no ADN. Esta (primeira) fase também demonstrou a adequabilidade da abordagem ex vivo para triagem de espermiotoxicidade, destacando o impacto de pesticidas em espécies não-alvo, como P. clarkii, devido ao papel crítico da integridade do ADN dos espermatozoides no sucesso da população. Como o penoxsulame mostrou ser o pesticida mais espermiotóxico, foi então o eleito para os testes subsequentes a realizar na 2ª fase. Assumindo que os efeitos nocivos dos pesticidas no ambiente podem ser estendidos além da escala temporal da exposição, a 2ª fase desta investigação começou com a avaliação da progressão do dano genético após uma exposição (7 dias) ao penoxsulame (Px: 23 μg L⁻¹) e um após o período de pós-exposição (70 dias), considerando células somáticas e espermatozoides do lagostim. A mesma abordagem foi aplicada ao genotóxico-modelo metanosulfonato de etilo (EMS; 5 mg L⁻¹), como via complementar para melhorar o conhecimento sobre a dinâmica da genotoxicidade (indução de dano no ADN vs. recuperação). Os resultados desta etapa demonstraram a genotoxicidade do Px em todas as células/órgãos testados (i.e., brânquias, hepatopâncreas e espermatozoides), mostrando também especificidades celulares e de género, com as células branquiais mostrando-se mais vulneráveis nas fêmeas, enquanto os machos demonstraram maior suscetibilidade no que concerne a células/órgãos internos (i.e., hepatopâncreas e espermatozoides). Em relação à ação do genotóxico-modelo, os lagostins foram incapazes de recuperar do dano induzido no ADN pelo EMS nas brânquias e no hepatopâncreas (em ambos os géneros), bem como nos espermatozoides. Os gametas masculinos mostraram ser o tipo celular mais vulnerável, enquanto o dano no ADN do hepatopâncreas só foi percetível após o período pós-exposição. Assim, ficou claro que a caracterização do risco genotóxico de um determinado agente deve integrar um conjunto de informações, abordando diferentes tipos de danos no ADN, especificidades de células/órgãos e género, bem como uma avaliação de longo prazo da progressão temporal do dano. A hipótese de que o dano a longo prazo causado pelo Px vai além da geração exposta foi testada através da observação de alterações na metilação e na integridade do ADN da prole, após uma exposição parental. Portanto, considerando um contexto intergeracional e o potencial genotóxico do Px, seguiram-se duas etapas (dentro da fase 2, supracitada). A primeira, consistiu na procura do entendimento da ação do Px sobre o metiloma de células musculares esqueléticas em duas gerações de lagostins. Assim, os organismos de F0 e da sua descendência (F1) foram expostos a Px (23 μg L⁻¹) e a EMS (5 mg L⁻¹). Os indivíduos adultos (F0) não apresentaram alterações no metiloma após a exposição ao herbicida. No entanto, a hipometilação que se observou nos juvenis da geração F1 não expostos (com exposição parental a Px) demonstrou que o histórico de exposição, per se, pode modular o epigenoma, apontando um efeito epigenético intergeracional. Nos descendentes F1 do grupo exposto a Px, a hipermetilação foi mais pronunciada nos machos do que nas fêmeas. Além disso, o EMS induziu hipometilação em fêmeas adultas (F0), destacando uma especificidade de género. O papel modulador de exposições passadas (parentais) em relação aos efeitos do penoxsulame ou EMS mostrou também depender do estágio de desenvolvimento da prole. Estes resultados provaram que uma influência indireta (ou seja, eventos de exposição ocorridos na geração anterior) pode ter um impacto maior na dinâmica epigenética do que exposições diretas. A segunda etapa incluiu exposições indiretas, adotando uma abordagem ex vivo, onde a integridade do ADN de espermatozoides dos indivíduos da geração F1 foi avaliada após uma exposição a Px ou EMS, com e sem a influência de uma exposição parental (F0), aos mesmos compostos. A exposição parental, isoladamente, não afetou a integridade do ADN dos espermatozoides da geração F1 (não expostos). No entanto, o histórico de exposição a Px aumentou a vulnerabilidade a lesões oxidativas de ADN na prole exposta ao mesmo agente. Os descendentes da geração exposta a EMS pareceram desenvolver mecanismos de proteção do ADN expressos quando também foram expostos a esse desafio genotóxico específico, revelando traços protetores advindos da história parental, revelando-a como um escudo toxicológico. O potencial espermiotóxico do Px só foi observado com um histórico de exposição parental a EMS, revelando, desta vez, a história de vida (exposição a Px) como uma “sombra” toxicológica (características negativas) para a descendência. Globalmente, os presentes resultados demonstraram que as recomendações de procedimentos regulatórios para proteção do ambiente aquático devem ser aprimoradas. Portanto, a presente investigação reforça a importância de uma avaliação (epi)genotóxica (combinando dois biomarcadores, a integridade do ADN e a metilação do ADN) abrangendo várias gerações. Além disso, no quadro da autorização de comercialização de pesticidas, deve-se considerar uma avaliação contínua desses agentes para determinar seu real impacto ambiental, o que pode ser considerado como um apelo à criação do conceito pesticidovigilância.