Epigenetic control of the male progenitor germline by the protein phosphatase PP1-NIP

Abstract

NIPP1, for nuclear inhibitor of protein phosphatase 1 (PP1), is a multifunctional scaffold protein that regulates cell signaling, pre-mRNA splicing and transcription by targeting PP1 to specific nuclear substrates. The global deletion of NIPP1 in mice is embryonic lethal at the onset of gastrulation, precluding its functional analysis in adult tissues. This prompted us to generate a tamoxifen-inducible NIPP1 knockout (iKO) mouse model. Unexpectedly, the deletion of NIPP1 was not efficient in the examined organs except for testis. The loss of NIPP1 caused an age-dependent progressive loss of testicular germ cells, culminating in a Sertoli cells-only phenotype. iKO testis showed a decreased proliferation of (un)differentiated spermatogonia and an increased level of apoptosis. Likewise, neonatal iKO testis exhibited an almost complete loss of gonocyte-derived (un)differentiated spermatogonia during the first wave of spermatogenesis. In addition, GFRA1+ progenitor cells isolated from induced iKO testis displayed a reduced proliferation potential. These data suggest that NIPP1 is required for the maintenance of undifferentiated spermatogonia. We also found that the observed phenotype was associated with the deregulation of genes that are implicated in the control of cell proliferation and survival. At the molecular level, the deletion of NIPP1 was associated with the loss of core components of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), which affects gene expression through trimethylation of histone H3 at Lys 27. The loss of PRC2 components could be explained by the hyperphosphorylation and degradation of EZH2, the catalytic subunit of the PRC2 complex, resulting in the destabilization of other PRC2 core components. The testis phenotype of the iKOs could be phenocopied by the chemical inhibition of EZH1/2 in organotypic testis cultures. Overall, our study uncovers a key function for PP1-NIPP1 in the regulation of EZH2 phosphorylation and stability, which is essential for the maintenance of germ cells.

NIPP1, inhibidor nuclear da protein phosphatase 1 (PP1), é uma proteina multifuncional que regula a sinalização celular, splicing do pre-mRNA e transcrição mediante o direcionamento da PP1 para substratos nucleares específicos. A deleção global da NIPP1 é letal durante o desenvolvimento embrionário no início da gastrulação, impedindo assim a sua análise funcional em tecidos de adultos. Este facto incitou-nos a gerar um modelo de ratinho knockout induzível (iKO) para a NIPP1. Inesperadamente, a remoção da NIPP1 não foi eficiente na maioria dos órgãos analisados, com exceção do testículo. A deleção da NIPP1 causou uma perda progressiva de células germinativas do testículo dependente da idade, culminando num fenótipo denominado Sertoli cells-only phenotype. O testículo adulto nos ratinhos iKO apresentaram uma diminuição na proliferação das espermatogónias (in)diferenciadas e aumento dos níveis de apoptose. De modo análogo, o testículo dos neonatos exibiu uma perda quase completa das espermatogónias (in)diferenciadas derivadas de gonócitos, durante o primeiro ciclo de espermatogénese. Adicionalmente, culturas celulares enriquecidas em células progenitoras GFRA1+ isoladas do testículo dos ratinhos iKO apresentaram uma diminuição do seu potencial proliferativo. Estes resultados sugerem que a NIPP1 é necessária para a manutenção das espermatogónias indiferenciadas. Demonstrámos também que fenótipo observado está associado à desregulação de genes implicados no controlo da proliferação e viabilidade celular. No que concerne o mecanismo molecular, a deleção da NIPP1 resultou na perda dos componentes centrais do complexo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2), o que afetou a expressão genética através da trimetilação da histone H3 no resíduo Lys27 (H3K27me3). A perda dos componentes integrantes do complexo PRC2 foi explanada pela hiperfosforilação e degradação da proteína EZH2, o componente catalítico central do complexo PRC2, resultando na subsequente destabilização de outros componentes deste complexo. Em conformidade, o fenótipo foi reproduzido através da inibição química da proteína EZH1/2 em culturas organotípicas de testículos. De modo geral, este estudo revela a importância da fosfatase PP1-NIPP1 para a regulação da fosforilação e estabilização da proteína EZH2, essencial para a manutenção das células germinativas.