Estudo da glicação da transferrina humana por espectrometria de massa

Abstract

A diabetes melito é uma patologia severa caracterizada pela hiperglicemia. Uma das consequências dos níveis elevados de glucose é a ocorrência de glicação não enzimática nas proteínas. A glicação resulta da formação de bases de Schiff entre aminas livres nas cadeias polipeptídicas e os açúcares redutores em circulação. Estudos anteriores verificaram um aumento considerável da glicação das proteínas do soro, incluindo a transferrina (Trf). Esta proteína é responsável pelo transporte de ferro pelo organismo e a sua glicação leva a uma diminuição da sua capacidade de ligação a este elemento. A alteração funcional da Trf pode levar a uma acumulação de espécies tóxicas de ferro no plasma e como consequência a um aumento dos efeitos deletérios deste metal de transição no organismo. No decorrer deste trabalho foi estudada a glicação in vitro da Trf por exposição a diferentes concentrações de D-glucose. A capacidade de ligação ao ferro foi avaliada por espectrofotometria e a espectrometria de massa (nano-HPLC-ESI-Ion Trap-MS/MS) foi utilizada para identificação dos aminoácidos suscetíveis à glicação. As experiencias in vitro demonstraram que os níveis de glicação aumentam com o aumento do tempo de exposição à D-glucose e da concentração da mesma. A capacidade de ligação ao ferro da Trf encontrava-se também diminuída nas amostras glicadas. Pela análise MS identificaram-se varias lisinas modificadas por glicação. As lisinas 206, 296 e 534, que participam na estabilização da ligação de ferro pela Trf, encontravam-se modificadas. Este resultado permite especular quanto à forma pela qual a glicação inibe ou dificulta a ligação do ferro pela Trf.

Diabetes mellitus is a severe pathology characterized by hyperglycemia. One of the consequences of high glucose is protein glycation. Glycation results from the formation of Schiff bases between the free amines within polypeptide chains and circulating reducing sugars. Previous studies have demonstrated an increase in the level of serum proteins glycation, including transferrin (Trf). Glycation of this protein leads to an impairment in its iron binding capacity. The functional alteration of Trf may lead to the accumulation of plasma toxic iron species and as a consequence to an increase in the deleterious effects of this transition metal in the organism. Glycated Trf, prepared in vitro by incubation with various concentrations of D-Glucose was examined in this study. The iron binding capacity and glycation level were verified by spectrophotometric methods, and mass spectrometry (nano-HPLC-ESI-Ion Trap-MS/MS) respectively. Tandem MS was used to identify the amino acid residues that are susceptible to undergo glycation. The in vitro experiments demonstrated that the glycation levels where increased with increased D-glucose concentrations and incubation time. It was also possible to obverse that Trf iron binding capacity was impaired by increasing glycation levels. The MS analysis revealed that several lysine residues where modified by glycation. Lysines 206, 296 and 534 (involved in the stabilization of iron binding) were found to be modified, rendering a fructoselysine moiety. These modifications may justify the impairment in iron binding capacity of Trf upon glycation.