Characterization of bioactive compounds of dealcoholized wine: valuation of distillation process

Abstract

O vinho tinto é uma importante fonte de compostos fenólicos com atividade antioxidante e que estão relacionados com a prevenção de doenças cardiovasculares e cancro. Estes compostos são um sub-produto do processo de destilação vínica utilizado para produzir aguardente necessária para a produção de Vinho do Porto. Esta tese tem como objetivo valorizar os compostos fenólicos resultantes das destilarias de vinho, através do estudo da sua composição, das interações com o material polimérico do vinho, da sua estabilidade durante o armazenamento e avaliação dos seus potenciais efeitos biológicos in vitro. Isto irá permitir definir aplicações para estes compostos como ingredientes alimentares com propriedades funcionais. Dois vinhos tintos (RW1 e RW2) foram utilizados como fonte de compostos fenólicos. A fim de estudar estes compostos, cada vinho foi evaporado à pressão atmosférica, permitindo obter o respetivo vinho desalcolizado (DW1 e DW2). Os polissacarídeos e compostos fenólicos presentes nos vinhos desalcolizados foram fracionados por extração em fase sólida utilizando cartuchos C18 sep-pak. A fração hidrofóbica, rica em compostos fenólicos, foi separada em frações ricas em ácidos fenólicos, em procianidinas e em antocianinas, as quais foram usadas para avaliar a sua contribuição para a atividade antioxidante total e caracterização fenólica detalhada dos DW. Foram obtidas quantidades comparáveis de compostos fenólicos totais (1.3 g/L para RW1 e DW1, e 3.1 para RW2 e DW2), de taninos (1.2 g/L para RW1 e DW1 e 1.6 para RW2 e DW2) e de antocianinas (0.24 g/L para RW1 e DW1 e 0.41 para RW2 e DW2) para os vinhos e para os respetivos vinhos desalcolizados. A determinação da atividade antioxidante de RW e DW pelos métodos do DPPH e ABTS também originou valores semelhantes, permitindo inferir que o processo de destilação realizado não promoveu uma perda relevante de compostos fenólicos. A atividade antioxidante total de vinho deveu-se essencialmente à fração rica em antocianinas. Os dois DW foram dialisados para se obter o material polimérico dos vinhos (WPM1 e WPM2). O WPM1 e WPM2 apresentavam 1.1 e 1.3 g/L de material sólido, respetivamente. O WPM (WPM1 e WPM2) era composto por polissacarídeos (31 e 36%), proteínas (10 e 12%) e também por compostos fenólicos (32 e 43%). A análise de açúcares mostrou que as manoproteínas e as arabinogalactanas eram os principais polissacarídeos presentes. A extração do WPM com metanol deu origem a um material insolúvel em metanol (PMi) e a uma fração solúvel em metanol, que continuava a conter hidratos de carbono e compostos fenólicos, mostrando uma forte interação entre estes compostos. Para determinar a energia de ativação (Ea) da libertação dos compostos fenólicos de fracções de material polimérico do vinho, foram realizadas diálises do DW, WPM e PMi, utilizando-se quatro concentrações diferentes, a cinco temperaturas (5-40 °C). O valor da Ea foi 25 para o WPM e 61 kJ/mol para o PMi, mostrando que os compostos fenólicos do vinho podem estar associados de forma diferente à matriz polimérica e que uma fração pode estar, ainda, fortemente associada a esta matriz. A fim de avaliar a possível existência de interações seletivas com os compostos fenólicos, o WPM foi fracionado, permitindo a obtenção de uma fração rica em manoproteínas (MP), através de uma cromatografia de afinidade com concanavalina A e 3 frações ricas em arabinogalactanas (AG0, AG1 e AG2) obtidas por cromatografia de troca aniónica. Foi avaliada a difusão de nove antocianinas monoméricas através de uma membrana de diálise, em presença do WPM, e das frações ricas em MP e em AG. A diálise dos compostos fenólicos livres do vinho foi realizada como ensaio em branco. Todas as frações poliméricas mostraram capacidade para reter as antocianinas, embora em diferente extensão. Foi observada uma capacidade de retenção maior para as antocianinas acilglucosiladas do que para as antocianinas glucosiladas. A fração rica em AG teve uma maior contribuição para a capacidade de retenção das antocianinas pelo material polimérico vinho do que a fração rica em MP, principalmente quando as antocianinas estavam acetiladas. Com o objetivo de estudar formas para preservar, a longo prazo, as propriedades antioxidantes dos compostos fenólicos, o extrato de compostos fenólicos (PCE), em pó, foi armazenado em diferentes condições de luz e atmosfera, à temperatura ambiente durante 1 ano. Observou-se que o PCE armazenado no escuro, dentro de um exsicador sob atmosfera de azoto, preservou 95% da atividade antioxidante inicial. Também foram avaliadas as melhores condições para preservar as antocianinas quando em solução, armazenadas a duas temperaturas (5 e 30 ºC) durante 3 meses. A adição de 0.5 g/L de uma fração rica em polissacarídeos a um vinho armazenado a 30 ºC promoveu a proteção das antocianinas, especialmente das antocianinas cumaroiladas. Os potenciais efeitos biológicos dos compostos fenólicos foram avaliados em diferentes sistemas celulares in vitro utilizando as seguintes frações: WPM, WPS (polissacarídeos do vinho), WPC (compostos fenólicos do vinho), PA-E (fração rica em ácidos fenólicos), PR-E (fração rica em procianidinas) e APP-E (fração rica em antocianinas e procianidinas poliméricas). Foi observada uma maior viabilidade celular quando as células do carcinoma do cólon HT-29 foram expostas a dois agentes oxidantes (radiação UV e H2O2) em presença das frações PR-E e APP-E. Além disso, os extratos WPS, WPC, PR-E e APP-E mostraram propriedades anti-inflamatórias, avaliadas pela inibição da produção de NO por células de macrófagos RAW264.7, sendo o extrato APP-E (0.19 mg/mL) o que exibiu a maior capacidade anti-inflamatória. A fim de elucidar as propriedades antioxidantes dos extratos do vinho em células humanas, os glóbulos vermelhos (RBC) foram selecionados como um modelo metabolicamente simples. Os extratos WPM, WPS, WPC, PR-E, e APP-E mostraram efeito anti-hemolítico para a hemólise dos RBC provocada pelo peróxido de hidrogénio (H2O2) e pelo di-hidrocloreto de 2,2'-azo-bis(2-diaminopropano) (AAPH). Os resultados obtidos permitem concluir que o processo de desalcoolização dos vinhos à pressão atmosférica, preservou as principais características antioxidantes dos compostos fenólicos. Estes compostos podem contribuir para a defesa das células contra agentes oxidantes, nomeadamente por terem um potencial de atividades anti-inflamatória e anti-hemolítica, promovendo a viabilidade celular. A interação dos compostos fenólicos do vinho com o material polimérico permite inferir uma dosagem contínua e gradual das antocianinas vinho tinto após a sua ingestão, contribuindo para um período mais longo da sua exposição e, como consequência, dos seus potenciais benefícios para a saúde.

Red wine is an important source of dietary intake of phenolic compounds with antioxidant activity and that are related to the prevention of cardiovascular diseases and cancer. These compounds are a major by-product of the wine distillation process used to produce the spirits required for production of Port Wine. This thesis aims to add value to the phenolic compounds resultant from wine distilleries by analyzing their composition, studying their interactions with the wine polymeric components, evaluating their stability upon storage, and assaying potential in vitro biological effects. This will allow to define applications as food ingredients for these compounds. Two red wines (RW1 and RW2) were used as source of phenolic compounds. In order to study these compounds, each wine was heat-evaporated at atmospheric pressure, allowing to obtain the respective dealcoholized wine (DW1 and DW2). The polysaccharides and phenolic compounds present in the DW were fractionated by solid phase extraction (SPE) using C-18 sep-pak cartridges, allowing to obtain the hydrophilic and hydrophobic fractions. The latter were further separated in phenolic acids-rich, procyanidins-rich and anthocyanins-rich fractions that were used to evaluate their contribution to the total antioxidant activity of DW and for the detailed phenolic characterization of DW by HPLC. Comparable amounts of total phenolic compounds (1.3 g/L for RW1 and DW1, and 3.1 for RW2 and DW2), tannins (1.2 g/L for RW1 and DW1 and 1.6 for RW2 and DW2), and anthocyanins (0.24 g/L for RW1 and DW1 and 0.41 for RW2 and DW2) were obtained. Also, the antioxidant activity of RW and DW, assayed by DPPH and ABTS, resulted in similar values, allowing to infer that the distillation process carried out did not promote relevant loss of phenolic compounds. The anthocyanins-rich fraction achieved the highest contribution to the total wine antioxidant activity. Both DW were dialyzed to obtain the wines polymeric material (WPM1 and WPM2). The WPM1 and WPM2 accounted for 1.1 and 1.3 g/L of solid material. They were composed of polysaccharides (31 and 36%) and proteins (10 and 12%) associated with phenolic compounds (32 and 43%). Sugar analysis showed that mannoproteins and arabinogalactans were the main polysaccharides present. From the extraction of WPM with methanol resulted a methanol insoluble (PMi) and a methanol soluble fraction, which still contained both carbohydrate and phenolic compounds, showing a strong interaction between these compounds. To determine the activation energy of phenolic release from the wine polymeric fractions, dialysis of DW, WPM and PMi, were performed using four different concentrations, and five temperatures (5-40 ºC) until a steady state was reached. The Ea was 25 and 61 kJ/mol for WPM1 and PMi fraction, showing that wine phenolic compounds can be differently associated with the polymeric matrix and a fraction can be even strongly associated into this matrix. In order to evaluate if a selective interaction exists between the phenolic compounds, the wine polymeric material was fractionated, allowing to obtain a mannoprotein-rich (MP) fraction using concanavalin A affinity chromatography and 3 arabinogalactan-rich fractions (AG0, AG1 and AG2) by anion-exchange chromatography. Using these compounds, the diffusion of nine monomeric anthocyanins through a dialysis membrane in presence of the WPM, MP and AG fractions was evaluated. In addition, the dialysis of free wine phenolic compounds was performed as a blank experiment. All polymeric fractions showed capacity for retaining the different anthocyanins, although in different extents. The higher retention capacity was observed for the acylglucosylated when compared with the glucosylated anthocyanins. The AG fraction had a higher contribution than MP fraction for retention capacity of wine polymeric material, especially when the anthocyanins were acetylated. The phenolic compounds extract (PCE) as a powder, was stored in different conditions of light and atmosphere, at room temperature for 1 year in order to study forms to preserve the antioxidant properties of these phenolic compounds in long-term storage conditions. It was observed that the PCE stored in the dark, inside a desiccator under a nitrogen atmosphere, preserved 95% of the initial antioxidant activity. It was also evaluated the best conditions to preserve the anthocyanins when in solution, stored at two temperatures (5 and 30ºC) during 3 months. The presence of 0.5 g/L of a polysaccharide-rich fraction in a wine solution stored at 30 ºC promoted the protection to the anthocyanin content, especially of coumaroylated anthocyanins. The potential biological effects of phenolic compounds were evaluated in different in vitro cellular systems using the fractions: WPM, WPS (wine polysaccharides), WPC (wine phenolic compounds), PA-E (phenolic acids fraction), PR-E (procyanidins-rich fraction), and APP-E (anthocyanins and polymeric procyanidins-rich fraction). A higher cell survival rate of HT-29 colon carcinoma cells was observed when they were exposed to two oxidative agents (UV radiation and H2O2) in presence of PR-E and APP-E extracts. Also, the WPS, WPC, PR-E and APP-E extracts showed anti-inflammatory properties using LPS-induced NO production in RAW 264.7 macrophage cells, where the APP-E extract (0.19 mg/mL) exhibited the highest capacity. In order to further elucidate the antioxidant properties of wine extracts in human cells, red blood cells (RBC) were selected as a metabolically simplified model system. The wine extracts (WPM, WPS, WPC, PR-E, and APP-E) showed anti-hemolytic effect of hydrogen peroxide (H2O2) and 2,2´-Azo-bis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) induced RBC hemolysis. The results obtained allowed to conclude that the dealcoholization process of wines at ambient pressure preserved the main antioxidant characteristics of phenolic compounds. These compounds may contribute for cell defenses against oxidative agents, namely having potential anti-inflammatory and anti-hemolytic activities, promoting cell viability. The interaction of wine phenolic compounds with the polymeric material allows to predict a continuous and gradual dosage of red wine anthocyanins upon ingestion, contributing for a longer period of their exposure and, as a consequence, of their potential health benefits.