The role of the NPTY functional domain on APP trafficking and processing

Abstract

A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença multifactorial e progressiva do sistema nervoso central. Apresenta uma incidência mundial de 2-7% em indivíduos com mais de 65 anos e de cerca de 50% em indivíduos acima dos 85 anos de idade. As principais alterações histopatológicas observadas nos doentes são a presença de tranças neurofibrilhares intracelulares e depósitos extracelulares de um peptídeo de 4 KDa denominado Abeta, que é o principal componente das placas de amilóide. Apesar da sua etiologia multifactorial, há uma correlação bem descrita entre esta patologia e o Abeta (peptídeo neurotóxico). O Abeta deriva fisiológica e proteoliticamente de uma glicoproteína transmembranar com características de receptor: a Proteína Percursora de Amilóide de Alzheimer (PPA). As possíveis funções fisiológicas da proteína PPA, o seu destino e vias de processamento celulares, conjuntamente com possíveis proteínas celulares que com ela interajam, são assim tópicos de interesse e áreas de investigação científica mundial. A PPA possui na sua estrutura primária sequências consenso para fosforilação, quer no seu ectodomínio quer no seu domínio intracelular, já descritas como sofrendo fosforilação “in vitro” e “in vivo”. Mais ainda, em alguns casos esta fosforilação está associada a estados de doença. Assim sendo, 7 dos 8 aminoácidos que hipoteticamente podem ser fosforilados no seu domínio intracelular encontram-se fosforilados em cérebros de doentes de DA, nomeadamente, Tyr653, Ser655, Thr668, Ser675, Try682, Thr686, Tyr687. O último pertence ao domínio funcional NPTY que é um sinal típico de endocitose em receptores associados à membrana e um local consenso para a endocitose. Várias proteínas interagem com este domínio intracelular da PPA, a maioria possui múltiplos domínios de interacção permitindo a formação de multi-complexos de sinalização entre a PPA e proteínas celulares. Existe assim a possibilidade dessas proteínas funcionarem como proteínas adaptadoras direccionando a PPA para vias de sinalização específicas. A interacção da PPA com essas proteínas de ligação parece ser regulada por fosforilação proteica, uma vez que a ligação da PPA à FE65 só ocorre quando a Thr668 está desfosforilada. O uso de proteínas de fusão PPA-GFP permitiu avaliar a função do domínio NPTY, através da mimetização do estado fosforilado (Y687E) e desfosforilado (Y687F) da Tirosina 687. Resultados contrastantes foram observados na localização subcelular destas proteínas. A proteína Y687E-PPA-GFP foi detectada na membrana plasmática mas não foi eficientemente incorporada em vesículas de tranferrina e apresentou uma diminuição significativa na produção de Abeta. Em contraste, a proteína Y687F-PPA-GFP é facilmente endocitada, tal como a proteína selvagem, e produziu mais Abeta, ou seja ocorreu um favorecimento da clivagem pela via da β-secretase. Os resultados obtidos indicam que este resíduo é importante para o direccionamento subcelular da proteína PPA e para o seu processamento nas diferentes vias, nomeadamente secretória e endocítica. A localização subcelular da PPA pode ser mediada por ligação a proteínas específicas. Um desses exemplos é a ligação da PPA à RTN3-B, uma vez que ambas co-localizam no retículo endoplásmico. Adicionalmente, os resultados apontam no sentido de que as interacções entre a PPA e as suas proteínas parceiras de ligação estejam dependentes do seu estado de fosforilação. Com este propósito o papel da Tirosina 687 no estabelecimento dessas interacções foi avaliado. Os resultados demostram que ambas as proteínas mutantes ligam FE65 e que esta última é a proteína que medeia a conexão entre a PPA e a PP1γ. As implicações destas observações na DA e em novas aplicações terapêuticas para a doença são subsequentemente discutidas.

Alzheimer’s disease (AD), the most common age-related dementing illness, is a progressive multifactorial neurodegenerative disorder of the central nervous system affecting individuals worldwide with an incidence of 2-7% of post-65 and 50% of post-85 years old. The pathological hallmarks of AD are the presence of intracellular neurofibrillary tangles and extracellular deposits of a 4kDa amyloid beta peptide (Abeta) forming amyloid plaques in the cerebral cortex. This disease is multifactorial in its etiology but central to its pathology is the neurotoxic Abeta peptide. Abeta arises from the proteolytic cleavage of a larger ubiquitous glycophosphoprotein, APP (Alzheimer Amyloid Precursor Protein), whose short cytoplasmic domain contains several phosphorylatable amino acids. The latter can be phosphorylated ‘in vitro’ and ‘in vivo’, and in some cases phosphorylation appears to be associated with the disease condition. Furthermore, it was demonstrated that 7 of the 8 potentially phosphorylatable residues in the intracellular domain of APP were phosphorylated in AD patients, namely Tyr653, Ser655, Thr668, Ser675, Tyr682, Thr686 and Tyr687. The latter lies within the NPTY domain, a typical internalization signal for membrane-associated receptor proteins, as well as a consensus sequence for coated-pit mediated internalization. Several proteins interact with the above mentioned cytoplasmic domain of APP, most of them possessing multiple protein-protein interacting domains, thus forming large multimolecular APP complexes. It appears therefore that these proteins function as adaptor proteins directing APP to specific molecular pathways. The interaction of APP with these binding proteins appears to be regulated by protein phosphorylation as has been described for FE65 binding, for example. Using APP-GFP fusion proteins to monitor intracellular pathways, the role of the NPTY domain was addressed by mimicking Tyr687 constitutive phosphorylation (Y687E) and dephosphorylation (Y687F), respectively. Contrasting effects on subcellular APP distribution were observed. Y687EAPP- GFP was targeted to the membrane but could not be detected in transferrin containing vesicular structures, and exhibited a concomitant and dramatic decrease in Abeta production. In contrast, Y687F-APP-GFP was endocytosed similarly to wild-type APP, but was relatively favoured for betasecretase cleavage. Overall, Tyr687 appears to be a critical residue determining APP targeting and processing via different pathways, including secretory, endocytic and retrograde transport. Significantly, from a disease perspective, mimicking Tyr687 phosphorylation resulted in a hitherto undescribed inhibition of Abeta production. Our results provide novel insights into the role of direct APP phosphorylation on APP targeting, processing and Abeta production. Targeting of APP is most likely mediated by binding to specific proteins. One such novel interaction identified was RTN3-B. These two proteins colocalize in the ER. Additionally, our conclusions so far, favour the model that interaction of APP with the binding proteins may also be mediated by the phosphorylation state of APP itself and with this proposal the role of Tyr687on protein-protein interactions was investigated. We demonstrated that FE65 binds to both Tyr687 mutants and also that FE65 is the bridging protein between APP and PP1γ. Our results provide novel insights into the role of direct APP phosphorylation on processing and Abeta production, pointing towards potential intervention strategies for the treatment of Alzheimer’s disease.