Cardosina A como modelo para o estudo da estabilidade conformacional de proteinases aspárticas

Abstract

As proteinases aspáticas (PA) constituem uma família das enzimas proteolíticas envolvidas em importantes processos biológicos. Nos últimos anos o conhecimento acerca das proteinases aspárticas tem aumentado devido ao interesse científico motivado pela descoberta do envolvimento destas enzimas em patologias humanas, como a SIDA, o cancro e a doença de Alzheimer. É conhecido que algumas destas doenças estão relacionadas com o folding incorrecto de proteínas. No entanto, são muito poucos os estudos realizados acerca do problema do folding de proteínas em proteinases aspárticas. A cardosina A é uma proteinase aspártica modelo, extraída a partir de C. cardunculus, é uma enzima heterodimérica que tem vindo a ser isolada, purificada e caracterizada. Neste trabalho foi estudado o equilíbrio de unfolding da cardosina A na presença de desnaturantes clássicos, como a ureia e o hidrocloreto de guanidina (GndHCl), conhecidos por promover o desenrolamento das proteínas estabilizando o estado desenrolado relativamente ao estado nativo. Os desnaturantes químicos são frequentemente utilizados para desnaturar proteínas e caracterizar mecanismos e estados de transição do enrolamento. A estabilidade conformacional da cardosina A na presença de ureia e GndHCl foi avaliada, utilizando ensaios de actividade, cromatografia de exclusão molecular (SEC), proteólise reduzida e métodos espectroscópicas como dicroísmo circular (CD) e fluorescência. Verificou-se que concentrações crescentes de desnaturante induzem a completa inactivação da cardosina A e a perda de estrutura secundária e terciária. No entanto, a desnaturação da cardosina A na presença destes desnaturantes mostrou ser um processo reversível. A não coincidência das curvas de desnaturação obtidas por fluorescência e por CD na região do UV-afastado, para ambos os desnaturantes, revelou que a cardosina A segue um mecanismo não cooperativo com formação de intermediários estáveis em equilíbrio. Ambos os desnaturantes induzem um desenrolamento independente das sub-unidades da cardosina A, sendo a sub-unidade menor a que apresenta uma menor estabilidade. A comparação dos mecanismos de desnaturação conduzidos na presença da ureia e do GndHCl mostra algumas diferenças, nomeadamente a dissociação das sub-unidades da cardosina A que ocorre apenas na presença do caotrópico com carácter iónico. A análise estrutural das moléculas de cardosina A e de pepsina A permitiu concluir que o seu estado oligomérico assim como as ligações dissulfito desempenham um papel importante na estabilidade conformacional das PAs.

Aspartic proteinases (AP) are a family of proteolytic enzymes involved in a number of important biological processes. In the last years, the knowledge on aspartic proteinases has improved by the research interest caused by the discovery that these enzymes are involved in human diseases, like AIDS, cancer and Alzheimer´s disease. It is known that several of these diseases are related to the abnormal folding of proteins. However, only a small number of studies about the problem of the protein folding of aspartic proteinases are available. Cardosin A is a model aspartic protease, from C. cardunculus, a heterodimeric enzyme that has been already isolated, purified and characterised. In this work, the unfolding equilibrium of cardosin A in the presence of chemical denaturants, such as urea and guanidine hydrochloride (GndHCl), was studied. These denaturants have long been known to unfold proteins by stabilizing the unfolded state compared to the native state. Chemical denaturants are frequently used to unfold proteins and characterise mechanisms and transition states of protein folding reactions. The conformational stability of cardosin A against the denaturation action of urea and GndHCl was investigated using proteolytic activity assays, exclusion size chromatography (SEC), limited proteolysis and spectroscopic methods as circular dichroism (CD) and fluorescence. Increasing denaturants concentrations lead to a complete inactivation of cardosin A and loss of secondary and tertiary structures. Nevertheless, the unfolding of cardosin A in the presence of these denaturants is a reversible process. No coincidence of transitions, when detected by different probes as fluorescence and Far-UV CD, for both urea and GndHCl, showed that a non-cooperative mechanism with stabilization of partially folded intermediaries is involved. Both denaturants lead to an independent unfolding of cardosin A subunits, where the light chain is less stable than the heavy chain. Nevertheless, Comparison of the denaturation mechanisms induced by the urea and GndHCl showed some differences: namely the heterodimer dissociation that occurs only in the presence of the chaotrope with ionic character. Structural analysis of cardosin A and pepsin A molecules demonstrated that the oligomeric state, as well as the disulfide bonds, have an important role on the conformational stability of APs.