Novo inibidor da (Na+/K+)ATPase : relevância para a neurotoxicidade do alumínio

Abstract

O alumínio é considerado um agente neurotóxico para o Homem desde 1886 tendo sido, desde então, demonstrada uma ampla gama de efeitos tóxicos do alumínio a nível celular. O presumível envolvimento da (Na+/K+)ATPase no desenrolar da acção neurotóxica do alumínio tem sido invocado por vários investigadores periodicamente. A (Na+/K+)ATPase, uma proteína integral da membrana plasmática de todas as células eucarióticas, é o receptor funcional dos esteroides cardiotónicos, como a ubaína, e uma bomba iónica de transdução energética, que converte a energia livre do ATP em gradientes electroquímicos iónicos (bomba de Na e K). Ao nível dos terminais nervosos cerebrais, concentrações submilimolares de AlCl3 reduzem a velocidade máxima da reacção hidrolítica e diminuem a sensibilidade da (Na+/K+)ATPase integrada na membrana a concentrações submicromolares de ubaína. Durante os últimos anos, foi caracterizada pormenorizadamente uma nova família de compostos anti-hipertensivos, que antagonizam o efeito da ubaína. Um destes compostos, nomeadamente o PST 2238, interage com a (Na+/K+)ATPase renal, formando complexos enzima-inibidor menos estáveis do que os formados na presença de ubaína. Ambos os compostos, AlCl3 e PST 2238, parecem ser inibidores não competitivos da (Na+/K+)ATPase e interferir na ligação de alta afinidade da ubaína à (Na+/K+)ATPase. A (Na+/K+)ATPase é caracterizada por uma heterogeneidade molecular complexa que resulta da expressão e associação diferenciada das múltiplas isoformas das subunidades catalíticas e reguladoras. Este estudo realizou-se com o objectivo específico de determinar se o PST 2238 inibe a (Na+/K+)ATPase localizada nos terminais nervosos cerebrais. Para tal, estudou-se o efeito do PST 2238 na (Na+/K+)ATPase em sinaptossomas isolados a partir do córtex cerebral do rato após congelamento e descongelamento. Observou-se que o PST 2238 inibe a actividade da (Na+/K+)ATPase sinaptossomal, de forma dependente da concentração. Na presença de concentrações saturantes de ATP, uma inibição de 10% foi observada na presença de PST 2238 0,5 nM, e para concentrações superiores a 60 μM foi registado o efeito inibitório máximo (~ 70%). Na gama de concentrações 50 nM – 5 μM foi observado um patamar intermédio de inibição moderada (30%) na curva "log dose-resposta". Na presença da concentração máxima inibitória de AlCl3 submicromolar (300 μM,) uma significativa redução dependente de concentração da actividade da (Na+/K+)ATPase só foi observada quando foram utilizadas concentrações elevadas de PST 2238 (> 5 μM). Em conclusão, o perfil de inibição do PST 2238 na (Na+/K+)ATPase cerebral parece ser diferente do encontrado no rim. O PST 2238 poderá ser útil no estudo do(s) mecanismo(s), mediado(s) pela (Na+/K+)ATPase, da acção neurotóxica do alumínio.

ABSTRACT: A wide range of toxic effects of aluminium has been demonstrated at cellular level since it was first recognized as a human neurotoxic agent in 1886. The putative involvement of the (Na+/K+)ATPase in the progress of the aluminium neurotoxic action has been claimed by several investigators periodically. The (Na+/K+)ATPase, an integral protein of the plasma membrane of all eukaryotic cells, is the functional receptor for cardiotonic steroids, such as ouabain, and an energy-transducing ion pump that converts the free energy of ATP into transmembrane ion gradients (Na-K pump). At the level of brain nerve terminals, submillimolar concentrations of AlCl3 reduce the maximal rate of the hydrolytic reaction and decrease the sensitivity of the membrane-bound (Na+/K+)ATPase to submicromolar concentrations of ouabain. During the last few years a new family of antihypertensive compounds that antagonize the pressor effect of ouabain has been characterized extensively. One of these compounds, namely PST 2238, was shown to act on the renal (Na+/K+)ATPase specifically by forming less stable enzyme-inhibitor complexes than the ones formed in the presence of ouabain. Both compounds, AlCl3 and PST 2238, seem to be non-competitive inhibitors of the (Na+/K+)ATPase and to interfere with the high-affinity binding of ouabain to (Na+/K+)ATPase. The (Na+/K+)ATPase is characterized by a complex molecular heterogeneity that results from the expression and differential association of multiple isoforms of both catalytic and regulatory subunits. This study was undertaken with the specific aim of determining whether PST 2238 inhibits the (Na+/K+)ATPase located at brain nerve terminals, by studying the effect of PST 2238 on (Na+/K+)ATPase of freeze-thawed synaptosomes isolated from rat brain cortex. We observed that PST 2238 inhibits the synaptosomal (Na+/K+)ATPase activity, in a concentration-dependent way. At non-limiting ATP concentration, inhibition (10%) was observed in the presence of 0.5 nM PST 2238, and concentrations higher than 60 μM promoted the maximal inhibitory effect (~70%). An intermediate plateau of moderate inhibition (30%) in “log dose - response curve” was observed in the 50 nM – 5 μM concentration range. In the presence of the maximum inhibitory concentration of submicromolar AlCl3 (300 ıM), a significant PST 2238 concentration-dependent reduction of the synaptosomal (Na+/K+)ATPase activity was only observed when high concentrations of PST 2238 (> 5 μM) were used. In conclusion, the (Na+/K+)ATPase inhibitory profile of PST 2238 in brain appears to be different than that found in kidney. PST 2238 could be of benefit to study the aluminium neurotoxic mechanism(s) involving (Na+/K+)ATPase.