Validação de método HPLC-UV para determinação de impurezas genotóxicas

Abstract

Impurezas genotóxicas (GIs) são compostos químicos, conhecidos ou suspeitos de serem mutagénicos e ou cancerígenos, que podem actuar directamente no ADN. Embora sejam aceitáveis doses diárias de 1,0-1,5 μg/dia deve ser aplicado um rastreio contínuo como uma medida para garantir a qualidade dos produtos farmacêuticos. Este é um assunto actual e relevante para a indústria farmacêutica e suas entidades reguladoras. Nesta perspectiva, a CIPAN tem-se empenhado em cumprir todas as exigências regulamentares mas também em contribuir para o desenvolvimento de novas metodologias de análise. É comum os APIs (Active Pharmaceutical Ingredients) conterem pequenas quantidades de impurezas resultantes de resíduos, subprodutos ou intermediários do processo. Em particular, os ácidos são frequentemente utilizados na indústria química como contra-iões, catalisadores ácidos ou como protectores de remoção de grupo durante os processos de síntese. Estes ácidos devem ser controlados abaixo de certos níveis pois na presença de um álcool podem formar ésteres de ácidos que são considerados GIs. Assim, a proposta deste trabalho é a validação de um método eficiente para a identificação e quantificação de ésteres eventualmente presentes num API. As análises foram realizadas num cromatógrafo líquido de alta pressão com detector de ultravioleta (HPLC-UV), usando o método de operação isocrático, uma coluna C-8 e outros parâmetros optimizados anteriormente no laboratório. Os ésteres em análise, éster 1 e éster 2, foram preparados por derivatização dos respectivos ácidos (matérias-primas na produção do API) com diazometano. Numa primeira etapa do trabalho, as soluções metanólicas das amostras eram filtradas antes da análise em HPLC. No entanto, detectaram-se alguns problemas analíticos inequivocamente associados à contaminação pelos filtros pelo que a etapa de filtração foi eliminada. Os resultados obtidos para a validação do método permitem concluir: i) os dois picos cromatográficos são completamente resolvidos; ii) a resposta é linear entre 3,0x10-04 mg/mL e 2,0x10-05 mg/mL; iii) para analistas e dias diferentes é preciso com RDS ≤ 10% e taxa de recuperação entre 98,0%; iv) o método é exacto, com valores de recuperação entre 90%-110%; v) os limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) são 2,0x10-05 mg/mL e 1,0x10-05 mg/mL, respectivamente. Finalmente, para aplicação do método em rotina determinou-se o factor de resposta relativo do éster 2 (preparado in situ) em relação ao éster 1 padrão. A determinação deste factor (RF=0.925) permitirá eliminar os procedimentos de esterificação in situ reduzindo simultaneamente o tempo de preparação das amostras e os riscos associados à síntese do diazometano.

Genotoxic impurities (GIs) are chemical compounds, known or suspected to be mutagenic and/or carcinogenic which can act directly on DNA. Althougt daily dosages of 1.0-1.5 μg/day are acceptable continuous screening of GIs in pharmaceuticals is a necessary measure for qualiy ensurance. Therefore, genotoxic impurities are a matter of great concern to the pharmaceutical industry and its regulators. As a result, CIPAN has been engaged in meeting all the regulatory requirements but also in taking a step forward in the development of new analysis methods as a preventive measure. It is common for APIs (Active Pharmaceutical Ingredients) to contain low amounts of impurities, resulting from waste materials, by-products or process intermediates. In particular, acids are often used in the the chemical industry either as counter-ions to form a salt, as acid catalysts or as protecting groups during synthesis. These acids must be controlled below certain levels because in the presence of an alcohol there is the possibility of forming acids esters which are considered GIs. The purpose of this study is the validation of an efficient method for the identification and quantification of sulphonic esters eventually present an API. The analysis were carried out in a high performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV), using isocratic operating conditions, a C-8 column and other operating parameters previously optimized in the laboratory. The esters under analysis, ester 1 and ester 2, were prepared by derivatization of the respective acids (raw materials in the API manufacture) with diazomethane. Prior to HPLC analysis the methanolic ester solutions were filtered. However, as discussed in detail herein this step was eliminated due to baseline problems clearly associated to the filters. The validation results obtained revealed: i) chromatograms with two completely resolved peaks; ii) the method is linear between 3.0x10-04 mg/mL and 2.0x10-05 mg/mL; iii) the method is precise for differents analysts and days with RSD ≤ 10.0% and recovery range 98.0%; iv) the method is accurate with recovery values between 90%-110%. The limits of quantification (LQ) and detection (LD) of the method are 2.0x10-05 mg/mL and 1.0x10-05 mg/mL, resepctively. Finally, for application of the method in routine analysis the relative response factor of methyl éster 2 in situ was evaluated in relation to ester 1 standard. The use of this correction factor (CF = 0.925) enables the simultaneous reduction of sample preperation time and the risks associated with diazomethane synthesis prodedures.