Understanding APP-dependent neuronal differentiation

Abstract

Amyloid Precursor Protein (APP) is a type 1 membrane protein that suffers proteolytic cleavages and has been implicated in roles such as cell adherence, survival, migration and differentiation. Although a role in neuritogenesis has been attributed to APP, some contradictory results have been reported regarding the benefits of knocking-down or overexpressing APP. Further, while the addition of the APP proteolytic sAPP (secreted APP) fragment to the cell medium enhances neuritogenesis, the amount of cellular APP and other APP fragments may be deleterious for this process. Further, preliminary work from the Neuroscience laboratory of the Center for Cell Biology indicated that pAPP (APP phosphorylated at the S655 residue) can potentially be crucial in APPmediated neuronal differentiation, for example by increasing APP cleavage to its biological fragment sAPP or APP binding to specific signal transducers. In this work, the capacity of APP and pAPP to mediate neuronal differentiation was tested, in the initial period of retinoic acid (RA)-induced SH-SY5Y cells differentiation. These neuroblastoma cells are a well documented neuronal-like cell model used in neuronal differentiation studies. Several molecular tools were used, including wild-type and phosphomutants APP-GFP. The evaluation of differentiation included neuritogenic output analysis by bright field and epifluorescence microscopy, using various approaches. Namely scoring the number of differentiated cells and performing morphometric analyses of transfected cells and of the all cellular population. The levels of APP and medium secreted sAPP, and of cytoskeleton-related proteins and posttranslational modifications, such as MAP2, Acetylated Tubulin and Actin were also quantified by Western blot analysis, and related to the morphological parameters. Additionally, the potential role of AICD in APP-mediated neuronal differentiation was inferred from pharmacologic assays, where its generation is inhibited. Together the results obtained show that APP, sAPP and AICD modulate neuritogenesis in a complex and well-ordered manner. While long-term increases in APP can be detrimental to neuronal-like differentiation, in an AICD-dependent manner, short-term increases benefit this process in an APP S655 phosphorylation dependent manner, potentially involving sAPP secretion and specific cytoskeleton rearrangements.

A Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer (PPA) é uma proteína membranar tipo 1 sujeita a processamento proteolítico que tem sido associada a funções como adesão celular, sobrevivência, migração e diferenciação. Apesar de lhe terem sido atribuídas funções na neuritogénese, os dados experimentais obtidos até à data que envolveram modulação dos níveis da PPA revelam-se contraditórios. De facto, enquanto a adição do fragmento PPA secretado (PPAs) ao meio celular favorece a neuritogénese, a quantidade de PPA celular e de outros fragmentos da PPA poderão já não constituir um benefício para este processo. Adicionalmente, dados preliminares do laboratório de Neurociências do Centro de Biologia Celular sugerem que a PPAp (PPA fosforilada na S655) poderá ser fundamental na diferenciação neuronal mediada pela PPA, nomeadamente por aumentar a proteólise da PPA a PPAs ou a ligação da PPA a sinais de transdução específicos. No presente trabalho, avaliou-se a capacidade da PPA e PPAp em mediar o período inicial de diferenciação neuronal induzida por ácido retinóico. Para tal recorreu-se a células de neuroblastoma SH-SY5Y, um modelo celular do tipo neuronal bem estabelecido para estudos de diferenciação. Adicionalmente, várias ferramentas moleculares, como PPA-GFP selvagem e fosfomutantes foram usadas. A avaliação da diferenciação incluiu a análise de vários parâmetros neuritogénicos por microscopia de luz (de campo claro e de fluorescência), nomeadamente monitorização de células diferenciadas e análises morfométricas das células transfectadas e da população geral. Os níveis de PPA e PPAs, e de proteínas relacionadas com citosqueleto e suas modificações pós-traducionais (MAP2, Tubulina Acetilada e Actina) também foram quantificados. Além do mais, a influência do DIP na diferenciação neuronal dependente de PPA foi avaliada usando um composto farmacológico para inibir a sua produção. De um modo geral, os resultados obtidos demonstram que a PPA, PPAs e DIP modulam a neuritogénese de um modo complexo e ordenado. Enquanto a indução de níveis altos de expressão de PPA (48h) podem ser detrimentais para a diferenciação tipo-neuronal, de uma forma dependente de DIP, induções mais breves (24h) beneficiam este processo de um modo dependente da fosforilação na S655, potencialmente envolvendo a secreção de PPA e rearranjos específicos do citosqueleto.