Local translation of candidate mRNAs for Down's Syndrome

Abstract

O Síndrome de Down (DS) é a causa genética mais frequente de atraso mental. À semelhança de outros síndromes em que ocorrem deficiências em termos de memória e aprendizagem, as anomalias em especial ao nível das espinhas dendríticas estão também presentes. As espinhas dendríticas exibem rápidas mudanças em número, tamanho, forma e motilidade. Estas mudanças estão associadas à plasticidade sináptica e requerem a síntese de proteínas in situ, ou seja, translação local dendrítica. Down Syndrome Cell Adhesion Molecule (DSCAM) é um dos genes importantes nesta patologia neuronal (DS). Neste trabalho foram analisadas isoformas de DSCAM (isoformas 1, 3, 4 e 5) originadas por poliadenilação alternativa e que contem motivos de regulação denominados Cytoplasmic Polyadenylation Element (CPE). Assim, a translação local dendrítica de algumas destas isoformas é regulada pela proteína CPEB. Para visualizar a expressão destas isoformas foram efectuadas construções com a proteína Kaede. Inicialmente esta proteína produz fluorescência em verde e após fotoconversão em vermelho e estimulação sináptica, a nova proteína sintetizada é observada novamente em verde. Neste trabalho foram utilizadas culturas de neurónios de hipocampo, transfectadas com as construções efectuadas com Kaede-DSCAM-isoforms e analisadas através de microscopia confocal. Aparentemente, as quatro isoformas de DSCAM tem distintos locais de expressão em neurónios. Kaede-DSCAM-Isoform 1 é expressa em dendrites e axónios mas não no corpo celular neuronal, enquanto que Kaede-DSCAM-Isoform 3 parece ser expressa em todos os compartimentos neuronais. A expressão de Kaede-DSCAM-Isoform 4 confere uma morfologia aberrante ao corpo celular neuronal no qual se expressa de forma intensa. Finalmente, a expressão de Kaede-DSCAM-Isoform 5 é visualizada na forma de grânulos, em neurites semelhantes a axónios. Apesar da estimulação sináptica não ter sido executada neste trabalho, a utilização de DSCAM Kaede-reporters representa uma ferramenta valiosa para a visualização da translação local em culturas neuronais de hipocampo. A aplicação desta metodologia em neurónios de hipocampo de ratos trissomicos Ts1Cje, pode também levar à obtenção de conclusões de extrema importância no que diz respeito ao papel de DSCAM em DS.

Down’s syndrome (DS) is the most frequent genetic cause of mental retardation. Like in other syndromes involving memory and learning impairment, synaptic structural abnormalities are present, especially at the level of dendritic spines. Dendritic spines undergo rapid changes in number, size, shape and motility. These changes are linked to synaptic plasticity and require in situ protein synthesis, that is, dendritic local translation. Down Syndrome Cell Adhesion Molecule (DSCAM) is an important gene for DS neuronal pathology. DSCAM isoforms analysed in this work (isoforms 1, 3, 4 and 5) are originated by alternative polyadenylation and bear different combinations of regulatory Cytoplasmic Polyadenylation Element (CPE) motifs. Thus, dendritic local translation of some of these isoforms is regulated by CPEB protein. To visualize the local expression of these isoforms, constructions with Kaede protein were made. Kaede protein initially produces green fluorescence, and after irreversible green to red photoconversion and synaptic stimulation, newly synthetized proteins can be observed in green. In this work, hippocampal neuronal cultures were transfected with DSCAM Kaede-based reporters and analysed by confocal microscopy. We have found that apparently, the four DSCAM isoforms have distinct expression locations in neurons. Kaede-DSCAM-isoform 1 is expressed in dendrites and axons but not in cell body whereas Kaede-DSCAM-isoform 3 appears to be expressed in all neuronal compartments. Kaede-DSCAM-isoform 4 expression seems to confer an aberrant morphological appearance to the neuronal cell body, where it is highly expressed. Finally, expression of Kaede-DSCAM-isoform 5 is visualized in form of granules that delineate axon-like neurites. Despite synaptic stimulation of neurons was not performed in this work, DSCAM Kaede-based reporters represent a valuable tool for visualizing DSCAM local translation in hippocampal neuron cultures. The application of this methodology to trisomic Ts1Cje mouse hippocampal neurons can also lead in the near future to valuable conclusions in what concerns the role of DSCAM in DS.