Cardosinas no estabelecimento de culturas primárias de neurónios

Abstract

O estabelecimento de culturas celulares primárias constitui um aspecto relevante para o estudo da biologia celular e molecular. Várias linhas celulares humanas estão disponíveis contudo, muitas adquiriram alterações genéticas significativas, incluindo a delecção de importantes genes reguladores. Neste sentido, é importante a criação de novos métodos que permitam aceder ao natural comportamento celular. Para analisar as actividades celulares relacionadas com a expressão de proteínas extracelulares da matriz, determinantes no processo de ramificação das neurites, procedeu-se ao desenvolvimento de um novo protocolo para isolamento e estabelecimento de culturas neuronais embrionárias de rato utilizando cardosinas. As cardosinas são proteases aspárticas de plantas, extraídas dos pistilos de Cynara cardunculus L., tendo sido usadas neste trabalho como uma nova ferramenta para desagregação de tecidos. As cardosinas foram comparadas com a tripsina, em termos de efeito durante o processo de isolamento de neurónios corticais. Conjuntamente, os resultados morfológicos e funcionais sugerem uma potencial aplicação das cardosinas em técnicas de isolamento de diferentes tipos celulares. Os resultados apresentam vantagens claras, em termos da viabilidade celular, do rendimento, sugerindo a implementação das cardosinas para isolamento celular, em alternativa à tripsina. Os neurónios corticais resultantes atingiram rácios de expressão MMPs/TIMPs após 24 horas em cultura proporcionais ao desenvolvimento e proliferação das neurites. A célere recuperação celular do processo de isolamento está relacionada com uma especificidade mais restrita das cardosinas o que suporta a sua aplicação, não só para o estabelecimento de culturas primárias, mas também para os procedimentos de subcultivo. Esta recuperação mais rápida sugere que, durante a desagregação do tecido nervoso, as cardosinas seguem um mecanismo menos agressivo para os neurónios que a tripsina. Este aspecto pode ter particular interesse em procedimentos de autotransplante, uma vez que a manipulação das culturas celulares deve preservar a integridade celular, para uma consequente reabilitação mais rápida do paciente.

The establishment of primary cell cultures is invaluable for studying cell and molecular biological questions. A variety of human cell lines exist, however, most have acquired significant genetic alterations from their cells of origin, including deletion of important regulatory genes. Therefore is important to create new methods to ascertain natural cell behaviour. In order to analyze cellular activities related to extracellular matrix protein expression, determinant for neurite pathfinding, a new protocol was established for isolating and culturing neuronal cells from embryonic rats by using cardosins. Cardosins are plant aspartic proteinases extracted from the pistils of Cynara cardunculus L. and were used in the present work as novel tool for tissue disaggregation. Cardosins were compared to trypsin effect in the isolation of cortical neurons. Both morphological and functional data suggest a potential application of cardosins in isolation techniques for different cellular types. The results demonstrate clear advantages, in terms of improved cell viability, increased yields, suggesting cardosins implementation as alternative to use trypsin for cell isolation. The resultant cortical neurons revealed to achieve MMPs/TIMPs expression ratio after the first 24 hours in culture matching with a superior neurite outgrowth and dendritic extension. This early cell recovery to isolation procedure is related to the narrow specificity of cardosins that support their application for establishment of primary cell culture and for subcultivation procedures. The increase on neuronal recover after cell plating suggesting that, during brain disaggregation, cardosins follow a mechanism that is less aggressive to neurons than trypsin. This could be particularly interesting for autotransplantation procedures, as cell culture manipulation would preserve cell integrity, leading to a faster patient rehabilitation.