Use of bacteriophages on the inactivation of pathogenic bacteria in aquaculture system

Abstract

A importância crescente da aquacultura a nível mundial contribui para compensar a progressiva redução das populações naturais de peixe. Contudo, o facto de várias pisciculturas sofrerem, frequentemente, grandes perdas económicas, devido a infecções causadas por microrganismos patogénicos, incluindo bactérias multiresistentes, torna urgente o desenvolvimento de estratégias menos lesivas para o ambiente. A Terapia fágica surge como uma potencial e emergente alternativa ao uso de antibióticos e outros antimicrobianos. O principal objectivo deste trabalho consistiu na avaliação da eficácia da terapia fágica para inactivar bactérias patogénicas de peixes em pisciculturas de regime semi-intensivo, sendo que para isso foram efectuados diversos estudos prévios. A dinâmica sazonal das comunidades virais e bacterianas foi seguida em amostras de água da piscicultura Corte das Freiras, tendo-se identificando as principais bactérias patogénicas e avaliado o nível de contaminação fecal. O número total de vírus foi determinado por microscopia de epifluorescência e a abundância relativa das principais bactérias patogénicas determinada por FISH (Fluorescent in situ hibridization). A dinâmica sazonal da comunidade bacteriana foi avaliada por 16S rDNA DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Uma vez que vibriosis e photobacteriosis representam duas das principais causas de mortalidade nos peixes em pisciculturas, a diversidade da comunidade bacteriana do género Vibrio também foi avaliada por DGGE. O nível de contaminação fecal foi avaliado através da quantificação do teor de coliformes fecais e de enterococos fecais, usando o método das membranas de filtração. Para o estudo da cinética da interacção bactériabacteriófago usou-se a infecção cruzada. Para aplicar com sucesso a terapia fágica é importante ter informações sobre a sobrevivência dos fagos e o seu impacto ecológico na estrutura da comunidade bacteriana após adição dos fagos das principais bactérias patogénicas de peixe. Os resultados obtidos mostram que o número total de vírus na água da aquacultura é bastante elevado, variando entre 6.1 x 109 particulas L-1 e 1.0 x1010 particulas L-1. O número total de bactérias permanece praticamente constante, contudo os grupos específicos de bactérias variam significativamente ao longo dos períodos de amostragem. No caso dos indicadores bacterianos, foi observada uma clara variação sazonal, com os níveis mais elevados de poluição fecal registados em Outubro de 2007 e os mais baixos registados em Maio 2009. A análise de fragmentos de 16S rDNA por DGGE sugere que a estrutura da comunidade bacteriana varia sazonalmente, verificado-se uma maior diversidade na estação mais quente. No caso do género Vibrio a análise por DGGE sugere também uma variação sazonal na comunidade bacteriana pertencente a este género, ainda que não tão evidente. Os resultados de infecção cruzada sugerem que, com excepção do fago de Aeromonas salmonicida , os fagos inoculados nas principais bactérias patogénicas de peixe apresentam um largo espectro de infecção do hospedeiro. A sobrevivência dos fagos na água da aquacultura variou, sendo que o fago de Aeromonas salmonicida sobreviveu aproximadamente 3 meses, enquanto o fago de Vibrio parahaemolyticus sobreviveu cerca de 15 dias. A adição dos fagos à comunidade bacteriana não conduziu a uma variação significativa na estrutura da comunidade bacteriana. Em conclusão, como o teor de vírus e a sobrevivência dos fagos na água da aquacultura são elevados e a adição dos fagos específicos das bactérias patogénicos tem um baixo impacto ecológico na estrutura da comunidade bacteriana natural, a terapia fágica pode ser aplicada com sucesso na inactivação das bactérias patogénicas de peixes. Além disso, a infecção múltipla pelos fagos aumenta a capacidade de inactivação de bactérias patogénicas. No entanto, como a densidade e a estrutura das comunidades bacterianas totais e patogénicas varia sazonalmente, torna-se necessário ter este facto em consideração aquando da escolha dos fagos a utilizar para terapia fágica.

Due to the increasing importance of aquaculture for the compensation of progressive worldwide reductions in natural fish stocks and to the fact that several fish farming plants often suffer from heavy financial losses due to the development of infections caused by microbial pathogens, including multidrug resistant bacteria, more environmentally-friendly strategies to control fish infections are urgently needed to make the aquaculture industry more sustainable. Phage therapy is an emerging and potential viable alternative to antibiotics and other antimicrobials. The main target of this work was to evaluate the use of phage therapy to inactive fish pathogenic bacteria in aquaculture systems, thus, several preliminary studies were developed. In this work the seasonal dynamics of viral and bacterial communities of the aquaculture system Corte das Freiras was followed, the main pathogenic bacteria were identified and the level of faecal contamination in the aquaculture was evaluated. The total number of viruses was determined by epifluorescence microscopy and the relative abundance of specific bacterial groups of was accessed by FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). The seasonal dynamics of bacterial community structure was evaluated using 16S rDNA DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). As vibriosis and photobacteriosis represent two of the main causes of fish mortality in fish farms, the diversity of the fish pathogens belonging to the Vibrio genus was also assessed by DGGE. The level of faecal contamination was evaluated through the quantification of faecal coliforms and faecal enterococci, using the membrane filtration method. The kinetics of pathogenic bacteria-phages interaction was also studied in laboratory, using cross infection. In order to apply phage therapy successfully, it is important to know the survival of the phage and the ecological impact of phage therapy in the diversity of bacterial communities after the additions of phages of the main fish pathogenic bacteria. The results obtained show that the number of viruses in the aquaculture water was high, varying between 6.1 x 109 cells L-1 and 1.0 x1010 cell L-1. The number total bacteria was almost constant over the year, but the specific bacterial groups varied significantly during the sampling period.A clear seasonal variation in bacterial indicators was observed, with the highest values of faecal bacteria occurring in October 2007 and the lowest in May 2009. The 16S rDNA DGGE results showed that bacterial community structure varied seasonally, showing a higher diversity during the warm season. The diversity of the Vibrio genus also showed a seasonal variation, but not so clear. The cross infection results showed that, with the exception of Aeromonas salmonicida phage, the phages inoculated on the main fish pathogenic bacteria displayed a large spectrum of host infection. The survival of the phages was variable; the Aeromonas salmonicida phage survived in aquaculture water during approximatelly three months and the phage of Vibrio parahaemolyticus survived only during fifteen days. Phage addition to the bacterial community did not result in a significant variation in bacterial community structure. In conclusion, as the level of viruses and survival of these phages are high in water from the aquaculture system and the addition of specific phages of pathogenic bacteria has a low ecological impact on the structure of the natural bacterial community, suggests that phage therapy can be a successful approach to inactivate fish pathogenic bacteria. Moreover, the occurrence of multiple infections by these phages improve their potential to inactive fish pathogenic bacteria. However, as the density and structure of total and pathogenic bacterial communities varied seasonally, it is necessary to take in consideration this variation when specific phages are selected for phage therapy.