Metabolic reprogramming of breast tumor associated macrophages

Abstract

Breast cancer (BC) is a complex and heterogeneous disease that poses a significant global health challenge. While advancements in early detection and treatment modalities have improved patient outcomes, challenges persist, particularly in addressing the aggressive and resistant nature of certain breast cancer subtypes. One promising avenue of research involves understanding and targeting the tumor microenvironment (TME) to develop more effective therapeutic strategies. Tumor-associated macrophages (TAM) are the predominant stromal cells in the breast TME and the abundance of pro-tumoral M2-like TAM correlates with unfavorable pathological and clinical features. Hence, shifting TAM polarization toward an M1-like anti-tumoral phenotype is an attractive strategy to elicit tumor regression and aid cancer treatment. The functional features of macrophages are intricately linked to their metabolism, with distinct metabolic programs of M1- and M2-like macrophages providing a sound rationale for exploring the therapeutic potential of macrophage modulation via metabolic reprogramming. In this work, we have employed an untargeted metabolomics approach to provide a comprehensive view of metabolic adaptations involved in the pro-tumoral TAM phenotype and its modulation by drugs targeting metabolic pathways. Initially, we established and characterized an in vitro model of tumor-educated macrophages (TEM). THP-1-derived macrophages were incubated in media conditioned by BC cells – specifically, the non-metastatic MCF-7 cell line, representative of the luminal A subtype, producing MCF-TEM; and the metastatic MDA-MB-231 cell line, representative of the highly aggressive triple negative breast cancer (TNBC) subtype to generate MDA-TEM. Employing NMR profiling of culture medium (exometabolomics) and of cell extracts (endometabolomics), we unveiled the metabolic adaptations of TEM, coupled with phenotypic characterization through qP CR and ELISA assays. Our findings suggested that TEM utilize alternative substrates, such as alanine, pyruvate and branched chain α-keto acids (BCKA) to compensate for shortages in glucose and glutamine within the conditioned media. Remarkable alterations in intracellular metabolic pathways were observed, including polyamine catabolism in MDA-TEM, collagen degradation in MCF-TEM and changes in adenosine metabolism, mainly in MDA-TEM. TEM also exhibited shifts in lipid composition, reflecting lipid droplet accumulation, cholesterol efflux, and membrane remodeling. Interestingly, following a second-stage incubation in fresh RPMI medium, TEM still displayed several metabolic differences compared to control macrophages (M0), which underscores the lasting impact of the BC cells-conditioned environment on macrophage behavior. In a subsequent stage, using the established in vitro model of MDATEM, we evaluated a selection of metabolic drugs (MDs) targeting different metabolic pathways. To assess their ability to skew the MDA-TEM phenotype towards an anti-tumoral state, we quantified the production of the pro-angiogenic factor VEGF and the well-established anti-cancer pro-inflammatory cytokine TNF-α. Dichloroacetate (DCA), 6-Aminonicotinamide (6-AN) and Etomoxir decreased VEGF secretion and enhanced the release of TNF-α, while significantly modulating the metabolome of TEM. Specifically, DCA induced the downregulation of glycolysis and consumption of extracellular lactate, glutamate and a-keto-b-methylvalerate, concomitant with the secretion of short chain fatty acids. Additionally, DCA reconfigured lipid metabolism by decreasing triglycerides and increasing cholesterol, showing a strong correlation with heightened TNF-α production in response to pro-inflammatory stimulation. The inhibition of the pentose phosphate pathway by 6-AN was accompanied by enhanced glutaminolysis, in contrast with glutamine release in untreated TEM. Notably, glutamine utilization exhibited a high correlation with the decrease in VEGF production. In the case of Etomoxir-treated TEM, compensation for inhibition of fatty acid oxidation occurred through the upregulation of glycolysis, accompanied by the catabolism of intracellular amino acids and increased consumption of extracellular BCKA and citrate. Altogether, the integration of exo- and endometabolomics elucidated how in vitro generated TEM reprogrammed their metabolism and phenotype in response to: i) the metabolic milieu imposed by distinct BC cells; ii) three metabolic drugs (DCA, 6-AN, and Etomoxir) that attenuated the pro-tumoral state of MDA-TEM. This comprehensive approach has unveiled several metabolites and metabolic pathways with potential immunoregulatory roles, thereby extending current understanding of the metabolism-phenotype axis in TEM.

O cancro da mama é uma doença complexa e heterogénea que representa um desafio significativo para a saúde global. Embora os avanços na deteção precoce e no tratamento tenham contribuído para uma melhoria do estado dos pacientes, os desafios persistem, particularmente no que diz respeito a certos subtipos tumorais, pela sua natureza agressiva e resistente. Uma abordagem de investigação promissora envolve a compreensão do microambiente tumoral (TME), utilizando-o como alvo para desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes. Os macrófagos associados a tumores (TAM) são as células do estroma predominantes no TME da mama. A abundância de TAM pró-tumorais (tipo M2) correlaciona-se com características patológicas e clínicas desfavoráveis. Desta forma, alterar a polarização dos TAM para um fenótipo anti-tumoral (tipo M1) representa uma estratégia atrativa para provocar a regressão do tumor e auxiliar no tratamento do cancro. As características funcionais dos macrófagos estão intrinsecamente ligadas ao seu metabolismo, apresentando perfis metabólicos distintos consoante os diferentes fenótipos. Esta diferença constitui uma motivação sólida para explorar o potencial terapêutico da modulação dos macrófagos através de reprogramação metabólica. Neste trabalho, recorremos a uma abordagem metabolómica não direcionada com o intuito de obter uma visão abrangente das adaptações metabólicas envolvidas no fenótipo pró-tumoral de macrófagos associados a tumores da mama e na sua modulação por fármacos que visam vias metabólicas específicas. Inicialmente, estabelecemos e caracterizamos um modelo in vitro de macrófagos educados por tumores (TEM). Macrófagos derivados de THP-1 foram incubados em meio condicionado por células tumorais de mama – especificamente, a linha celular não metastática MCF-7, representativa do subtipo luminal A, para produzir MCF-TEM; e a linha metastática MDA-MB-231, representativa do subtipo triplo negativo, altamente agressivo, para gerar MDA-TEM. A análise dos perfis de RMN de meios de cultura (exometabolómica) e de extratos celulares (endometabolómica), complementada pela caracterização fenotípica através de qPCR e ELISA, possibilitou a revelação de numerosas adaptações metabólicas nos TEM. Os nossos resultados mostraram que os TEM recorrem a substratos alternativos, como a alanina, o piruvato e α-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKA), para compensar a escassez de glucose e glutamina nos meios condicionados pelas células tumorais. Foram observadas alterações consideráveis em vias metabólicas intracelulares, com impacto no catabolismo de poliaminas nos MDA-TEM, na degradação do colagénio nos MCF-TEM, e no metabolismo da adenosina, sobretudo nos MDA-TEM. Destacam-se também alterações na composição lipídica dos TEM, evidenciando a acumulação de gotas lipídicas, o efluxo de colesterol e a remodelação membranar. Curiosamente, após uma segunda incubação em meio RPMI novo, os TEM mantiveram diversas diferenças metabólicas em comparação com os macrófagos controlo (M0), ressaltando o impacto duradouro do ambiente metabólico criado pelas células tumorais no comportamento dos macrófagos. Numa etapa subsequente, recorrendo ao modelo in vitro previamente estabelecido de MDA-TEM, avaliamos uma seleção de fármacos direcionados para diferentes enzimas metabólicas e proteínas reguladoras. Com o intuito de avaliar a capacidade destes fármacos em reverter o fenótipo de MDA-TEM para um estado anti-tumoral, quantificamos a produção do fator pró-angiogénico, VEGF, e da citocina próinflamatória anti-tumoral TNF-α. Os fármacos Dicloroacetato (DCA), 6- Aminonicotinamida (6-AN) e Etomoxir diminuíram a secreção de VEGF e aumentaram a secreção de TNF-α, ao mesmo tempo que provocaram alterações significativas no metaboloma dos TEM. Especificamente, o DCA induziu a diminuição da glicólise e o consumo de lactato extracelular, glutamato e a-cetob- metilvalerato, concomitantemente com a secreção de ácidos gordos de cadeia curta. Além disso, o DCA reconfigurou o metabolismo lipídico, diminuindo os níveis de triglicerídeos e aumentando os níveis de colesterol, alterações que demonstraram uma forte correlação com o aumento da produção de TNF-α em resposta à estimulação pró-inflamatória. A inibição da via das pentoses fosfato pelo 6-AN foi acompanhada por um aumento da glutaminólise, contrastando com a secreção de glutamina observada nos TEM não tratados. Notavelmente, a utilização de glutamina demonstrou uma elevada correlação com a diminuição na produção de VEGF. No caso dos TEM tratados com Etomoxir, a compensação da inibição da oxidação dos ácidos gordos ocorreu através da regulação positiva da glicólise, acompanhada pelo catabolismo de aminoácidos intracelulares e pelo maior consumo de BCKA e de citrato. Em suma, a integração da exo- e endometabolómica contribuiu para clarificar a reprogramação do metabolismo e fenótipo dos TEM em resposta: i) ao ambiente metabólico imposto por diferentes tipos de células tumorais de mama; ii) a três fármacos metabólicos (DCA, 6-AN e Etomoxir), que atenuaram o estado pró-tumoral dos TEM. Esta abordagem abrangente revelou vários metabolitos e vias metabólicas com potenciais papéis imunoreguladores, ampliando assim a compreensão atual do eixo metabolismofenótipo nos TEM.