Bioelectronic tongue for the detection of paralytic shellfish toxins

Abstract

Paralytic shellfish toxins (PSTs) are a group of potent phytotoxins produced by some microalgae species. During out-of-control proliferation of this species, seafood can accumulate high levels of PSTs, posing a health threat to consumers and having important economic impact on aquaculture worldwide. Though monitoring programs were established, they are based in time-consuming and expensive techniques. Most biosensors and assays developed up to date detect primarily the most common of PSTs - saxitoxin (STX). As PSTs is a group of more than 50 analogues with varying toxicity in mammals, several of which occur simultaneously, development of sensors for their detection is a challenging task. This work aimed to develop an array of (bio)sensors or a bioelectronic tongue for the rapid detection of a wide range of PSTs in bivalve tissue extracts. Current knowledge of several PST-transforming enzymes that were identified to date was assessed in a review and their biological functions and potential practical applications were discussed. One of the promising applications of PST transforming enzymes is the development of enzymatic biosensors, which are becoming an alternative for the development of fast and low-cost analytical tools. Using one of the PST-transforming enzymes, carbamoylase, an assay for the detection of the N-sulfocarbamoyl GTX5 toxin was developed. Carbamoylase was extracted from the surf clam Spisula Solida, and its characterization was performed. Carbamoylase hydrolyzes carbamoyl and N-sulfocarbamoyl toxins into decarbamoylated ones. Using a potentiometric sensor with plasticized PVC membrane sensitive to the product of the enzymatic hydrolysis of GTX5 toxin, dcSTX, as a detector, an enzymatic assay allowed the indirect determination of GTX5 in the concentration range from 0.43 to 3.30 μmol L−1, which correspond to the concentration levels observed in the contaminated bivalve extract and encompasses European Union regulatory limits for PSTs. In addition to GTX5, other N-sulfocabamoyl toxins are also present in bivalves from the Portuguese coast during G. catenatum blooms, accounting for 70% of the total toxicity. Taking advantages of conformational changes occurring in carbamoylase during enzymatic reaction, another enzymatic assay was implemented based on impedimetric electronic tongue. The detection of a sum of N-sulfocarbamoyl PSTs, GTX5, GTX6 and C1+2, was achieved with a detection limit of 0.1 μmol L-1, in the concentration levels typically observed in bivalves with PST toxicity. Performance of the impedimetric electronic tongue was validated in the extracts of mussels caught during PST toxicity episodes. Specific combination of PSTs observed in bivalves depends on both toxin producing microalgae and bivalve species. Therefore, apart from N-sulfocarbamoyl PSTs, other PSTs, such as decarbamoyl and carbamoyl, need to be detected for estimation of the total sample toxicity. With the objective of detecting a wider range of PST analogues, an electronic tongue based on potentiometric chemical sensors was developed. A range of potentiometric chemical sensors was characterized in the solutions of eight PSTs representative of two toxin profiles produced by G. catenatum and A. minutum. Taking advantage of different sensor parameters of eight sensors in individual analyte solutions, a method for sensor selection for an electronic tongue based on simulated sensor responses and Lasso regularization was developed in order to minimize both quantification errors and number of sensors in the array. The experimental validation with mixed solutions of STX and GTX2+3 demonstrated that the proposed methodology is a rapid and efficient tool for selecting sensors for the electronic tongue.

As toxinas marinhas paralisantes (PST) são um grupo de potentes fitotoxinas produzidas por algumas espécies de microalgas. Durante a proliferação descontrolada de microalgas, os bivalves podem acumular elevados níveis de PST, representando uma ameaça à saúde dos consumidores e tendo um importante impacto económico na aquacultura em todo o mundo. Vários programas de monitorização foram estabelecidos, mas estes baseiam-se em técnicas que são dispendiosas e demoradas. A maioria dos biossensores e dos ensaios desenvolvidos até à data baseiam-se principalmente na deteção da PST mais comum: a saxitoxina (STX). Como as PST são um grupo de mais de 50 análogos que possuem diferentes toxicidades em mamíferos, e que ocorrem em simultâneo, o desenvolvimento de sensores para sua deteção torna-se uma tarefa desafiadora. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma série de (bio)sensores ou de uma língua bio eletrónica para a deteção rápida de uma ampla gama de PST em extratos de tecidos de bivalves. Foi efetuada uma revisão do conhecimento atual de várias enzimas transformadoras de PST identificadas até o momento, discutindo-se as suas funções biológicas e potenciais aplicações práticas. Uma das aplicações promissoras destas enzimas é no desenvolvimento de biossensores enzimáticos, dispositivos que se têm tornando uma alternativa como ferramentas analíticas rápidas e de baixo custo. Utilizando uma das enzimas transformadoras de PST, a carbamoilase, foi desenvolvido um ensaio para a deteção da toxina N-sulfocarbamoilo GTX5. A carbamoilase foi extraída da amêijoa Spisula Solida, realizando-se depois a sua caracterização. Esta enzima hidrolisa as toxinas carbamoilo e N-sulfocarbamoilo convertendo-as nos respetivos análogos descarbamoilados. Utilizando como detetor um sensor potenciométrico com membrana de PVC plastificado sensível ao produto da hidrólise enzimática da toxina GTX5, a dcSTX, o ensaio enzimático desenvolvido permitiu a determinação indireta de GTX5 na faixa de concentração de 0,43 a 3,30 μmol L−1, que corresponde às concentrações observadas no extratos de bivalves contaminados abrangendo os limites regulamentares da União Europeia para PST. Para além da GTX5, outras toxinas do grupo N-sulfocabamoilo estão também presentes em bivalves da costa portuguesa durante a proliferação de G. catenatum, representando 70% da sua toxicidade total. Tirando vantagem das mudanças conformacionais que ocorrem na carbamoilase durante a reação enzimática, outro ensaio enzimático foi desenvolvido tendo como base uma língua eletrónica impedimétrica. A deteção do total das PST do grupo N-sulfocarbamoilo, GTX5, GTX6 e C1+2, foi alcançada com um limite de deteção de 0,1 μmol L-1, que são os níveis de concentração tipicamente observados em bivalves com toxicidade devido a PST. O desempenho da língua eletrónica impedimétrica foi validado em extratos de mexilhões capturados durante episódios de toxicidade de PST. O perfil de PST observado em bivalves depende tanto das microalgas produtoras de toxinas quanto das espécies de bivalves contaminados. Assim, além das PST do grupo N-sulfocarbamoílo, outras PST, como as do grupo descarbamoílo e carbamoílo, devem ser detetadas para ter uma estimativa da toxicidade total da amostra. Com o objetivo de detetar uma gama mais ampla de análogos de PST, foi desenvolvida uma língua eletrónica baseada em sensores químicos potenciométricos. Foi caracterizada uma gama de sensores químicos potenciométricos em soluções de oito PST, representativas de dois perfis de toxinas produzidas por G. catenatum e A. minutum. Aproveitando os diferentes parâmetros obtidos com oito sensores em soluções de analitos individuais, foi desenvolvido um método para seleção dos sensores para a construção de uma língua eletrónica, tendo como base as respostas simuladas dos sensores e a regularização Lasso, de forma a se minimizarem os erros de quantificação e o número de sensores constituintes. A validação experimental com soluções mistas de STX e GTX2+3 demonstrou que a metodologia proposta é uma ferramenta rápida e eficiente para a seleção de sensores para língua eletrónica.