Phage therapy in the control of Vibrio alginolyticus in Artemia franciscana

Abstract

Vibrio species are a major cause of diseases in marine fish and invertebrate hatcheries, resulting in significant economic losses. Moreover, these bacteria can be transmitted to humans through the consumption of undercooked or raw seafood, posing a risk to public health. Artemia nauplii, commonly used as live food in aquaculture, has been considered a possible source of Vibrio species contamination, including Vibrio alginolyticus. It serves as a vehicle for these bacteria into culture tanks and affecting fish health and consumers. The most common treatments for biocontrol of bacterial contamination in live feeds in aquaculture involve commercial disinfectant and antibiotics. However, the antibiotics should be avoided due to development of bacterial resistance. Additionally, the process of bacterial decontamination of live feeds must neither compromise their viability nor transform the live feed into a hazardous chemical food. One promising alternative to conventional treatments is the use of phage therapy to control Vibrio species. Bacteriophages (or phages) are bacterial viruses and their antibacterial nature through induction of bacterial lysis, their high host specificity and rapid reproduction, enable them to control bacterial populations. The use of phages to control bacterial infections caused by Vibrio species has been reported across numerous fields by many researchers. However, relatively the use of phages to control V. alginolyticus in Artemia, there is only one study. Therefore, two new phages (TDD and SRI) were isolated, characterized and their efficacy was evaluated separately and in cocktail (TDD/SRI) to control V. alginolyticus in vitro and in vivo. Phages TDD and SRI infect only its host (V. alginolitycus CECT 521). In general, the increase of multiplicity of infection (MOI) from 1 to 100 not promoted a significant increase in the efficiency of phages TDD and SRI. In vitro experiments, in culture medium, two single phage suspensions and phage cocktail were effective against V. alginolyticus, but phage TDD (reduction of 5.8 log CFU/mL after 10 hours of incubation) was more effective than phage SRI (maximum reduction of 4.6 log CFU/mL after 6 hours of incubation) and phage cocktail (maximum reduction of 5.2 log CFU/mL after 8 hours of incubation). In synthetic seawater, the same profile of inactivation was observed, the phage TDD was also the most efficient one (reduction of 4.3 log CFU/mL) when compared with the phage SRI (reduction of 2.1 log CFU/mL) and phage cocktail (reduction of 1.9 log CFU/mL). When Artemia franciscana was treated with the single phage suspensions (TDD and SRI) and phage cocktail, a 0.5, 1.0 and 0.9 log CFU/mL of reduction, was reached after 24 hours, respectively, inactivating the total V. alginolyticus added to Artemia cultures without affecting its microbiota. The results of this study suggest that the phages TDD and SRI can be an effective alternative to control V. alginolyticus in Artemia nauplii. However, in the future, new phages need to be isolated and tested together with phages TDD and SRI to produce a cocktail with a broader spectrum of activity against V. alginolyticus and even to control other Vibrio species associated with Artemia culture.

As espécies de Vibrio são uma das principais causas de doenças em peixes marinhos e em incubadoras de invertebrados, resultando em grandes perdas económicas. Além disso, estas bactérias podem ser transmitidas aos seres humanos através do consumo de frutos do mar mal cozinhados ou crus, representando um risco para a saúde pública. Os náuplios de Artemia, comumente usados como alimento vivo na aquacultura, têm sido considerados uma possível fonte de contaminação de espécies de Vibrio, incluindo Vibrio alginolyticus. Estes servem como veículo para essas bactérias entrarem nos tanques de cultura, afetando a saúde dos peixes e dos consumidores. Os tratamentos mais comuns para o biocontrole da contaminação bacteriana em alimentos vivos na aquacultura envolvem desinfetantes comerciais e antibióticos. No entanto, os antibióticos devem ser evitados devido ao desenvolvimento de resistência bacteriana. Além disso, o processo de descontaminação bacteriana dos alimentos vivos não deve comprometer a sua viabilidade nem transformar os alimentos em químicos perigosos. Uma alternativa promissora aos tratamentos convencionais é o uso da terapia fágica para controlar espécies de Vibrio. Os bacteriófagos (ou fagos) são vírus bacterianos e o seu potencial anti-bacteriano por meio da indução da lise bacteriana, a sua elevada especificidade relativamente ao hospedeiro e a rápida reprodução, permitem-lhes controlar as populações bacterianas. O uso de fagos para controlar infeções causadas por espécies de Vibrio foi relatado em diversas áreas por muitos investigadores. No entanto, relativamente ao uso de fagos para controlar V. alginolyticus em Artemia existe apenas um estudo. Por isso, dois novos fagos (TDD e SRI) foram isolados, caracterizados e sua eficácia avaliada separadamente e em cocktail (TDD/SRI) para controlar V. alginolyticus in vitro e in vivo. Os fagos TDD e SRI infetam apenas o seu hospedeiro (V. alginolitycus CECT 521). Em geral, o aumento da multiplicidade de infeção (MOI) de 1 para 100 não promoveu um aumento significativo na eficiência dos fagos TDD e SRI. Nos ensaios in vitro, em meio de cultura, as duas suspensões de fagos individuais e o cocktail de fagos foram eficazes contra V. alginolyticus, mas o fago TDD (redução de 5,8 log CFU/mL após 10 horas de incubação) foi mais eficaz do que o fago SRI (redução máxima de 4,6 log CFU/mL após 6 horas de incubação) e o cocktail de fagos (redução máxima de 5,2 log CFU/mL após 8 horas de incubação). Na água do mar sintética, foi observado o mesmo perfil de inativação, o fago TDD também foi o mais eficiente (redução de 4,3 log CFU/mL) quando comparado com o fago SRI (redução de 2,1 log CFU/mL) e o cocktail de fagos (redução de 1,9 log CFU/mL). Quando a Artemia franciscana foi tratada com as suspensões de fagos individuais (TDD e SRI) e o cocktail de fagos, uma redução de 0,5, 1,0 e 0,9 log CFU/mL foi alcançada após 24 horas, respetivamente, inativando o total de V. alginolyticus adicionado às culturas de Artemia sem afetar a sua microbiota. Os resultados deste estudo sugerem que os fagos TDD e SRI podem ser uma alternativa eficaz para controlar V. alginolyticus em náuplios de Artemia. Porém, no futuro, é necessário isolar e testar novos fagos juntamente com os fagos TDD e SRI para produzir um cocktail com um espectro de infeção mais amplo contra V. alginolyticus e até mesmo para controlar outras espécies de Vibrio associadas à cultura de Artemia.