Developing epigenetic biomarkers of metal exposure in Daphnia

Abstract

Freshwater ecosystems are global hotspots for biodiversity but these have been drastically transformed by human activities; it is therefore paramount to promote their protection and sustainable use. In this regard, the feasible evaluation of ecotoxic effects of environmental contaminants supports the conclusions reached within Environmental Risk Assessment (ERA) frameworks, but the development of efficient biomarkers remains a major problem in this context. Epigenetics refers to the study of heritable changes in gene expression that occur without modifications in DNA sequence. While epigenetic mechanisms have been moving to the forefront of human health and environmental research, epigenetic biomarkers remain far from a complete integration into ERA frameworks. Thus, the main objective of this Thesis was to explore the development of epigenetic biomarkers towards establishing/incorporating them in environmental sciences stages and ERA of chemicals in particular, using Daphnia magna and metals as model organism and contaminants, respectively. In a first theoretical stage, the role of epigenetic biomarkers was acknowledged in human health sciences and their potential explored in different ecotoxicological contexts. Crucially, this exercise revealed that epigenetic responses fulfil several important criteria as biomarkers and present numerous advantages in comparison to others, as well as that DNA methylation currently shows the most potential for biomarker development among epigenetic mechanisms. The potential of epigenetic biomarkers was then appreciated in the context of the ERA of chemicals, and their incorporation into such frameworks postulated. In a second experimental stage, multigenerational DNA methylation, transcriptional and life-history responses were assessed following copper exposure, as well as the influence of past exposure to this metal in such responses. A relatively small number of genes showed methylation and transcriptional changes in exposed organisms, with methylation changes mostly targeting important genes for counteracting the effects of metal and oxidative stress. This highlighted a certain degree of specificity of such methylation responses and hinted to their possible connection to the observed transcriptional changes, thereby revealing some of their characteristics as biomarkers and potential to serve as epigenetic biomarkers in ERA. Furthermore, the history of exposure to copper determined distinct methylation and transcriptional changes in exposed organisms, as well as their transgenerational extension across the following non-exposed generations. This showed that the molecular responses of newly exposed organisms can be critically constrained by previous exposure to metals, and that epigenetic and transcriptional forms of inheritance contribute to the long-lasting biological effects resulting from chemical exposure. Also, major transcriptional changes were observed in histone modifier genes, thus suggesting the interplay of different epigenetic mechanisms towards detoxification and adaptation from/to metals in Daphnia. At last, the role of DNA methylation was explored in bystander effects, herein reflecting the “horizontal” transmission of information – rather than the “vertical” one, i.e. transgenerational – regulating organisms’ responses. In accordance to the findings above, both copper and cadmium induced methylation changes in exposed daphnids through targeting genes involved in general stress responses and offset of metal toxicity and oxidative stress, thus reinforcing the potential role of epigenetic biomarkers in ERA also for the evaluation of responses to short-term direct metal exposure. Besides, bystander responses at the DNA methylation level were detected for both metals, and these seemed required for the cellular signalling of metal stress and protection from DNA damage. This then extended the role of epigenetic biomarkers beyond the scope of directly exposed organisms and transgenerational effects, ultimately demonstrating their far-reaching applicability in terms of environmental monitoring. Taken together, the findings of this Thesis bring into light the potential of embracing epigenetic biomarkers in environmental sciences and ERA of chemicals.

Os ecossistemas de água doce são hotspots de biodiversidade à escala global mas têm sido drasticamente transformados pelas atividades humanas; por conseguinte, é fundamental promover a sua proteção e utilização sustentável. Neste sentido, a avaliação rigorosa dos efeitos ecotóxicos de contaminantes ambientais é necessária para suportar as conclusões que sejam alcançadas no âmbito da Análise de Risco Ecológica (ARE), mas o desenvolvimento de biomarcadores eficientes continua a ser problemático neste contexto. A epigenética refere-se ao estudo das alterações hereditárias da expressão genética que não evolvem modificações na sequência do ADN. Embora os mecanismos epigenéticos tenham vindo a ganhar destaque no âmbito da investigação em saúde humana e ambiental, os biomarcadores epigenéticos continuam longe de uma integração completa nas abordagens de ARE. Assim, o principal objetivo desta Tese foi explorar o desenvolvimento de biomarcadores epigenéticos, no sentido de os estabelecer/incorporar no contexto das ciências ambientais e, em particular, na ARE de químicos, utilizando Daphnia magna e metais como organismo e contaminantes modelo, respetivamente. Numa primeira etapa de cariz teórico, o papel dos biomarcadores epigenéticos foi revisto nas ciências da saúde humana e o seu potencial foi explorado em diferentes contextos ecotoxicológicos. É de destacar que este exercício revelou que as respostas epigenéticas preenchem vários requisitos importantes enquanto biomarcadores e possuem numerosas vantagens em comparação com outros, bem como que a metilação do ADN apresenta, no presente, o maior potencial para o desenvolvimento de biomarcadores de entre os mecanismos epigenéticos. O potencial dos biomarcadores epigenéticos foi então analisado no contexto da ARE de químicos e a sua incorporação nestas abordagens de avaliação ambiental postulada. Numa segunda etapa de cariz experimental, as respostas multigeracionais ao nível da metilação do ADN, transcrição e história de vida foram avaliadas após exposição ao cobre, bem como a influência da exposição passada a este metal nestas respostas. Um número relativamente pequeno de genes demonstrou alterações na metilação e transcrição nos organismos expostos, sendo que estas alterações de metilação visaram, maioritariamente, genes importantes para contrariar os efeitos do metal e stress oxidativo. Estes resultados evidenciaram um certo grau de especificidade destas respostas de metilação, bem como sugerem a sua possível ligação às alterações transcricionais observadas, revelando assim algumas das suas características enquanto biomarcadores e o seu potencial para servirem como biomarcadores epigenéticos em ARE. Mais ainda, a história de exposição ao cobre determinou alterações distintas na metilação e transcrição nos organismos expostos, bem como a sua extensão transgeracional às gerações seguintes (não expostas). Isto demostrou que as respostas moleculares de organismos expostos podem ser criticamente condicionadas pela exposição passada a metais, e que as heranças epigenética e transcricional contribuem para os efeitos biológicos duradouros que resultam da exposição a químicos. Além disso, foram observadas alterações transcricionais consideráveis em genes modificadores de histonas, sugerindo assim a interação de diferentes mecanismos epigenéticos para a desintoxicação de e adaptação a metais em Daphnia. Por último, o papel da metilação do ADN foi explorado nos efeitos bystander, refletindo aqui a transmissão "horizontal" de informação – em vez da "vertical", ou seja, transgeracional – que regula as respostas dos organismos. De acordo com os resultados acima referidos, tanto o cobre como o cádmio induziram alterações na metilação das dáfnias expostas, visando genes envolvidos em respostas gerais ao stress e contrabalanço da toxicidade dos metais e stress oxidativo, reforçando assim o potencial papel dos biomarcadores epigenéticos em ARE para a avaliação das respostas à exposição direta a curto prazo aos metais. Além disso, foram detetadas respostas bystander ao nível da metilação do ADN para ambos os metais, e estas pareceram ser necessárias para a sinalização celular do stress causado pelos metais e para a proteção contra danos no ADN. Estes resultados alargam o papel dos biomarcadores epigenéticos para além do âmbito dos organismos diretamente expostos e dos efeitos transgeracionais, demonstrando, em última análise, o seu grande alcance em termos de aplicabilidade na monitorização ambiental. No seu conjunto, as conclusões desta Tese revelam o potencial da adoção de biomarcadores epigenéticos nas ciências ambientais e na ARE de químicos.