Effects of antidepressants in zebrafish under ecologically relevant exposure scenarios

Abstract

The increasing contamination of aquatic environments by selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) antidepressants represents a growing challenge with potential risks to ecosystems and human health. Taking into account the high degree of structural similarity between fish and humans, these antidepressants class can act in a similar way in fish, potentially being susceptible to the same biochemical and physiological mechanisms of action. Fluoxetine belongs to this class and is one of the most frequently detected antidepressants in surface waters. Thus, this work aimed to evaluate the impact of short- and long-term exposure to environmentally relevant concentrations of fluoxetine on zebrafish, at different stages of development, through an integrated analysis at various levels of biological organization. The overall hypothesis of this thesis is that environmental levels of fluoxetine may modulate molecular, physiological and behavioral endpoints, that may compromise fish fitness and survival. The initial steps in this thesis involved a literature review to prepared to provide a current view of existing studies with fluoxetine, in order to understand the dynamics of the response at different levels of biological organization in freshwater fish, identifying the most susceptible targets and the potential consequences of exposure to this drug, detecting existing research gaps and directions for future research to better understand the consequences of this SSRI on fish and populations. After the literature review, in an attempt to provide needed data on the topic, the effects of environmentally relevant concentrations of fluoxetine (from 1 to 1000 ng/L) on zebrafish embryos/larvae were evaluated after a short-term exposure of 8 days. Effects on important endpoints were evaluated, such as embryonic development, behavior, biochemical markers associated with antioxidant response, gene expression and neurotransmitters levels belonging to the monoaminergic system. Additionally, the relation between behavior, gene expression and neurotransmitter levels was discussed. The effects of chronic exposure to relevant concentrations of fluoxetine on juvenile zebrafish were evaluated also studied. In experimental design involved exposures for 21 days to 0.1, 1, and 10 μg/L, and evaluation of effects at the sub-individual level (biochemical markers) and at the individual level (locomotion, thigmotaxis, exploration and sociability). In a final set of assays, the transgenerational effects of a 15-day parental exposure to environmentally relevant concentrations of fluoxetine (100 and 1000 ng/L) were evaluated. The effects on embryonic development, behavior at different stages of life (8 days, 1, 2 and 3 months), gene expression (8 days and 3 months) and neurotransmitter profiles (8 days and 3 months) were evaluated. Overall, the results of the literature review revealed that although studies on the effects of fluoxetine at different levels of biological organization have been performed, there are considerable research gaps. A large percentage of the studies assess behavioral effects (without standardizing methods), but there is a great lack of information on parameters that can help to understand these behavioral changes, such as gene expression, biochemical markers, circadian rhythm and neurotransmitters. The data obtained in the laboratory show that environmentally relevant concentrations of fluoxetine can cause a more noticeable effect in the early stages of zebrafish development, resulting in changes on ontogenic development, neurotransmitter levels, gene expression of monoaminergic systems and behavior. Low concentrations of fluoxetine in the order of ng/L can cause a transgenerational effect in zebrafish offspring. These effects were observed at the level of embryonic development of offspring, behavior, gene expression and levels of monoaminergic neurotransmitters. Furthermore, persistence of effects on behavior, gene expression and monoaminergic neurotransmitters in offspring was observed until adulthood, suggesting that fluoxetine can induce epigenetic changes, with the possibility of affecting future generations. Overall, effects of exposures to low concentrations of fluoxetine was found. The detected sublethal effects can compromise fish fitness and species continuity, leading to further consequences at the population level. Thus, further research with environmentally realistic concentrations of antidepressants should be performed, with organisms at different stages of development and submitted to longer exposure periods. Transgenerational and multigenerational studies with fish, should be considered a relevant approach to assess the potential impact of antidepressants on aquatic ecosystems.

A crescente contaminação dos ambientes aquáticos por antidepressivos inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) representa um desafio cada vez maior com potenciais riscos para os ecossistemas e para a saúde humana. Tendo em conta o elevado grau de semelhança estrutural entre os peixes e os seres humanos, esta classe de antidepressivos pode atuar de forma semelhante nos peixes, sendo potencialmente suscetíveis aos mesmos mecanismos bioquímicos e fisiológicos de ação. A fluoxetina pertence a esta classe e é um dos antidepressivos mais frequentemente detetados em águas superficiais. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o impacto da exposição a curto e longo prazo a concentrações ambientalmente relevantes de fluoxetina no peixe-zebra, em diferentes estádios de desenvolvimento, através de uma análise integrada a vários níveis de organização biológica. A hipótese geral desta tese é que os níveis ambientais de fluoxetina podem modular parâmetros moleculares, fisiológicos e comportamentais, comprometendo a aptidão e a sobrevivência dos peixes. Os passos iniciais desta tese envolveram uma revisão bibliográfica preparada para fornecer uma visão atual dos estudos existentes com a fluoxetina, de forma a compreender a dinâmica da resposta a diferentes níveis de organização biológica em peixes de água doce, identificando os alvos mais suscetíveis e as potenciais consequências da exposição a este fármaco, detetando lacunas de investigação existentes e direções para futuras investigações para melhor compreender as consequências deste SSRI em peixes e populações. Após a revisão da literatura, numa tentativa de fornecer os dados necessários sobre o tema, foram avaliados os efeitos de concentrações ambientalmente relevantes de fluoxetina (de 1 a 1000 ng/L) em embriões/larvas de peixe-zebra após uma exposição a curto prazo de 8 dias. Foram avaliados os efeitos em parâmetros importantes, como o desenvolvimento embrionário, o comportamento, os marcadores bioquímicos associados à resposta antioxidante, expressão génica e os níveis de neurotransmissores pertencentes ao sistema monoaminérgico. Além disso, foi discutida a relação entre comportamento, expressão génica e níveis de neurotransmissores. Foram também estudados os efeitos da exposição crónica a concentrações relevantes de fluoxetina no peixe-zebra juvenil. O desenho experimental envolveu exposições durante 21 dias a 0.1, 1 e 10 μg/L, e a avaliação dos efeitos a nível sub-individual (marcadores bioquímicos) e a nível individual (locomoção, tigmotaxia, exploração e sociabilidade). Num conjunto final de ensaios, foram avaliados os efeitos transgeracionais de uma exposição parental de 15 dias a concentrações ambientalmente relevantes de fluoxetina (100 e 1000 ng/L). Foram avaliados os efeitos sobre o desenvolvimento embrionário, o comportamento em diferentes fases da vida (8 dias, 1, 2 e 3 meses), expressão génica (8 dias e 3 meses) e perfis de neurotransmissores (8 dias e 3 meses). Globalmente, os resultados da revisão da literatura revelaram que, embora tenham sido efetuados estudos sobre os efeitos da fluoxetina em diferentes níveis de organização biológica, existem lacunas consideráveis na investigação. Uma grande percentagem dos estudos avalia os efeitos comportamentais (sem padronização de métodos), mas existe uma grande falta de informação sobre parâmetros que podem ajudar a compreender estas alterações comportamentais, como a expressão genética, marcadores bioquímicos, ritmo circadiano e neurotransmissores. Os dados obtidos no laboratório mostram que concentrações ambientalmente relevantes de fluoxetina podem causar um efeito mais percetível nas fases iniciais do desenvolvimento do peixe-zebra, resultando em alterações no desenvolvimento ontogénico, nos níveis de neurotransmissores, na expressão génica dos sistemas monoaminérgicos e no comportamento. Baixas concentrações de fluoxetina da ordem de ng/L podem causar um efeito transgeracional na descendência do peixe-zebra. Estes efeitos foram observados ao nível do desenvolvimento embrionário da descendência, comportamento, expressão génica e níveis de neurotransmissores monoaminérgicos. Além disso, foi observada a persistência dos efeitos no comportamento, expressão génica e nos neurotransmissores monoaminérgicos da descendência até à idade adulta, sugerindo que a fluoxetina pode induzir alterações epigenéticas, com a possibilidade de afetar as gerações futuras. Em geral, foram detectados efeitos de exposições a baixas concentrações de fluoxetina. Os efeitos subletais detetados podem comprometer a aptidão dos peixes e a continuidade das espécies, levando a outras consequências a nível da população. Assim, devem ser efetuados mais estudos com concentrações ambientalmente realistas de antidepressivos, com organismos em diferentes fases de desenvolvimento e submetidos a períodos de exposição mais longos. Os estudos transgeracionais e multigeracionais com peixes devem ser considerados uma abordagem relevante para avaliar o potencial impacto dos antidepressivos nos ecossistemas aquáticos.