Impact of caffeine on zebrafish: a case study with environmental levels

Abstract

Caffeine (CAF) is an environmental contaminant detected in aquatic environments around the world, as a consequence of high consumption, thus serving as an indicator of anthropogenic pollution. Although CAF's effects have been widely evaluated in different organisms, little is known about the effects of environmental concentrations of CAF on non-target organisms, such as fish. In this context, we investigated in this thesis the toxicity of environmental concentrations of CAF in adult zebrafish (Danio rerio) and explored the influence of personality traits on this toxicity. Furthermore, we evaluated the sensitivity of zebrafish at three stages of embryonic development and examined the influence of temperature on CAF toxicity in juvenile zebrafish. Chapters 2, 3 and 4 describe the effects of short and long-term exposure of zebrafish to environmental concentrations (0, 0.5, 1.5, and 300 μg. L-1). Short-term exposure (7 days) demonstrated the ability of CAF to reduce the exploratory behaviour of zebrafish at all concentrations tested (0.5, 1.5, and 300 μg. L-1), increased the latency time of feeding when fish were exposed to 1.5 and 300 μg. L-1, and decreased the growth rate and weight of fish at a concentration of 300 μg. L-1. CAF also induced aggressive behaviour at all concentrations (0.5; 1.5; 300 μg. L-1) and has been shown to reduce the preference for the shoal (sociability) in fish exposed to 0.5, and 1.5 μg. L−1. Long-term exposure (30 days) demonstrated the ability of CAF to increase the latency time of fish to respond to feeding when fish were exposed to 0.5 μg. L-1, and to reduce the growth and weight of fish when exposed to 300 μg. L-1. Additionally, CAF at concentrations of 0.5 and 1.5 μg. L-1 was shown to increase the average swimming speed of fish, and at all concentrations tested (0.5, 1.5, 300 μg. L-1) it increased the fish's response to mirror image and sociability. At a biochemical level, CAF, at all concentrations (0.5, 1.5, 300 μg. L-1) tested, inhibited the activity of acetylcholinesterase (AChE), while 300 μg. L-1 increased lactate dehydrogenase (LDH) activity and cortisol levels. In chapter 4, it was evaluated whether shy and bold fish have different sensitivities to CAF (0, 0.5, 1.5, 300 μg. L-1) after short-term exposure (7 days). CAF has been shown to interact with personality traits (bold and shy) in the locomotion activity, aggression, and sociability of fish. Exposure to 300 μg. L-1 of CAF induced hyperactivity, reduced aggression, and sociability in shy fish. On the other hand, CAF did not influence the behaviour of bold fish. These responses demonstrated that environmental concentrations of CAF can induce behavioural and biochemical changes in zebrafish, highlighting that populations with certain personality traits are more vulnerable to the effects of CAF. Chapter 5 describes zebrafish responses to CAF at different stages of embryonic development (2-120, 72-120, 96-120 hours post fertilization (hpf); 5 days of exposure - 5dE, 2 days of exposure - 2dE, and 1 day of exposure - 1dE, respectively) and highlights the stage of development where the fish were most sensitive to CAF. CAF demonstrated the ability to reduce the total distance travelled by fish and increase erratic movements at all stages of development [5dE (67 and 100 mg. L-1), 2dE (20, 30, 44, 67, and 100 mg. L-1) and 1dE (67, and 100 mg. L-1)]. However, based on the lowest observed effect concentration (LOEC) for the total distance travelled (20 mg. L-1) and the greatest inhibition of AChE activity (100 mg. L-1; 65%), fish of scenario 2dE are more sensitive to CAF. These results demonstrate that after the immediate loss of the chorion, fish become more sensitive to the effects of CAF, therefore they can be used in the evaluation of different substances, such as nanomaterials or chemicals that are difficult to penetrate the chorion. Chapter 6 describes the effects of acute exposure (96 h) of CAF on juvenile fish cultured at 22 ºC and 27 ºC. Short-term exposure demonstrated the CAF's ability to reduce the distance fish swam, increase erratic swimming, and inhibit AChE activity in juveniles reared and exposed to 22 ºC. At 27 ºC, CAF did not affect behaviour, but increased AChE activity. There was an interaction between CAF and temperature on behavioural endpoints, but not on AChE activity. These results demonstrate that temperature plays an important role in the effects induced by CAF. The results showed that the evaluation of behavioural and biochemical effects addressed in this thesis was fundamental to deepen the understanding of CAF toxicity at environmental concentrations. Furthermore, behavioural tests have been shown to be sensitive to low concentrations of CAF, allowing differentiation of responses between fish with different personality traits. This highlighted the sensitivity of these tests and reinforced the need to include them in the assessment of risks associated with environmental contaminants.

A cafeína (CAF) é um contaminante ambiental detetado amplamente em ambientes aquáticos em todo o mundo, devido ao seu elevado consumo, sendo, portanto, considerada um indicador de poluição antropogénica. Embora os efeitos da CAF tenham sido extensivamente avaliados em diferentes organismos aquáticos, pouco se sabe sobre os efeitos de concentrações ambientalmente relevantes de CAF nestes organismos não-alvo, como os peixes. Desta forma, nesta tese examinou-se a toxicidade de concentrações ambientais de CAF em peixes-zebra (Danio rerio) adultos e explorou-se como os traços de personalidade podem influenciar essa toxicidade. Além disso, avaliou-se a sensibilidade do peixe-zebra em três estágios de desenvolvimento embrionário e investigou-se o impacto da temperatura na toxicidade da CAF em peixes-zebra juvenis. Nos capítulos 2, 3 e 4 são descritos os efeitos da exposição a curto e longo prazo a concentrações ambientais (0; 0,5; 1,5; 300 μg. L-1) de CAF em peixe-zebra. A exposição a curto prazo (7 dias) demonstrou a capacidade da CAF para reduzir o comportamento exploratório do peixe-zebra em todas concentrações testadas (0,5; 1,5; 300 μg. L-1), aumentar o tempo de latência da alimentação quando os peixes foram expostos a 1,5 e 300 μg. L-1, diminuir a taxa de crescimento e o peso do peixe na concentração de 300 μg. L-1, induzir o comportamento agressivo em todas as concentrações e reduzir a preferência pelo cardume (sociabilidade) a 0.5 e 1.5 μg. L−1. A exposição a longo prazo (30 dias) demonstrou a capacidade da CAF para aumentar o tempo de latência dos peixes na resposta à alimentação quando os peixes foram expostos a 0.5 μg. L-1 e para reduzir o crescimento e o peso dos peixes quando expostos a 300 μg. L-1. Adicionalmente, a CAF nas concentrações de 0,5 e 1,5 μg. L-1 demonstrou aumentar a velocidade média de natação dos peixes, e aumentou a resposta dos peixes à imagem no espelho e a sociabilidade em todas concentrações testadas. A nível bioquímico, a CAF, em todas as concentrações testadas, inibiu a atividade da acetilcolinesterase (AChE), enquanto a 300 μg. L-1 aumentou a atividade da lactato desidrogenase (LDH) e os níveis de cortisol. No capítulo 4, avaliou-se se peixes tímidos e ousados possuem diferentes sensibilidades à CAF (0; 0,5; 1,5; 300 μg. L-1) após exposição de curta duração (7 dias). A CAF demonstrou interagir com traços de personalidade (ousado e tímido) na atividade de locomoção, na agressividade e na sociabilidade dos peixes. A exposição a 300 μg. L-1 de CAF induziu hiperatividade, reduziu a agressividade e a sociabilidade em peixes tímidos. Por outro lado, a CAF não influenciou o comportamento dos peixes ousados. Estas respostas demonstraram que concentrações ambientais de CAF são capazes de induzir mudanças comportamentais e bioquímicas em peixes-zebra, destacando que populações com determinados traços de personalidade são mais vulneráveis aos efeitos da CAF. No capítulo 5 são descritas as respostas do peixe-zebra à CAF em diferentes estágios do desenvolvimento embrionário (2-120, 72-120, 96-120 horas pós fertilização (hpf); 5 dias de exposição- 5dE, 2 dias de exposição- 2dE e 1 dia de exposição- 1dE, respetivamente). Adicionalmente, foi identificado o estágio de desenvolvimento mais sensível à CAF. A CAF demonstrou capacidade para reduzir a distância total percorrida pelos peixes e aumentar os movimentos erráticos em todos os estágios do desenvolvimento [5dE (67 e 100 mg. L-1), 2dE (20, 30, 44, 67 e 100 mg. L-1) e 1dE (67 e 100 mg. L-1)]. Entretanto, com base na menor concentração de efeito observada (LOEC) para a distância total percorrida (20 mg. L-1) e na maior inibição da atividade da AChE (100 mg. L-1; 65%), os peixes do cenário 2dE demonstraram ser mais sensíveis à CAF. Estes resultados demostram que após a perda imediata do córion, os peixes são mais sensíveis aos efeitos da CAF, portanto podem ser utilizados na avaliação de substâncias diversas, como nanomateriais ou produtos químicos de difícil penetração no córion. No capítulo 6 são descritos os efeitos da exposição aguda (96 h) à CAF em peixes juvenis cultivados a 22 ºC e a 27 ºC. A exposição a curto prazo demonstrou a capacidade da CAF para reduzir a distância percorrida pelos peixes, aumentar o nado errático e inibir a atividade da AChE em juvenis criados e expostos a 22 ºC. A 27 ºC, a CAF não afetou o comportamento, mas aumentou a atividade da AChE. Houve uma interação entre CAF e temperatura nos endpoints comportamentais, mas não na atividade da AChE. Estes resultados demonstram que a temperatura desempenha um papel importante nos efeitos induzidos pela CAF. Os resultados evidenciaram que a avaliação de efeitos comportamentais e bioquímicos empregada nesta tese foi fundamental para aprofundar o entendimento da toxicidade da CAF em concentrações ambientais. Além disso, os testes comportamentais demonstraram ser sensíveis a concentrações baixas de CAF, permitindo a diferenciação de respostas entre peixes com diferentes traços de personalidade. Isso realçou a sensibilidade desses testes e reforçou a necessidade de incluí-los na avaliação de riscos associados a contaminantes ambientais.