Peripheral immune response and its epigenetic modulation in human refractory epilepsy: a preliminary study

Abstract

Epilepsy isa chronic neurological disorder that affects 70 million people worldwide. In adults, Mesial Temporal Lobe Epilepsy with Hippocampal Sclerosis (MTLE-HS) is the most common refractory epilepsy, with over 80% of patients’ refractory to pharmacological treatment. Inflammation is a recognized epilepsy hallmark and exacerbated neuroinflammation has been described in all epileptogenic stages. In response to neuronal damage, glial cells and endothelial cells release pro-inflammatory cytokines, activating the NF-kB pathways, ultimately leading to the expression of more inflammatory genes, such as Interleukin-1β (IL-1β). Although initially it is beneficial, when exacerbated it can become detrimental, with studies reporting an association between IL-1β levels and seizure generation, in the hippocampus of patients with epilepsy. During neuroinflammation, monocytes can infiltrate the central nervous system (CNS). Recent research has identified a specific subpopulation of monocytes, called disease inflammatory macrophages (DIMs), which are characterized by overexpression of pro-inflammatory cytokines. DIMs were found expanded in epilepsy and are thought to contribute to brain inflammation by regulating cytokine expression. Additionally, dysregulated cytokines levels have been described in serum of patients with epilepsy. Despite, the real contribution of peripheral immune cells in epilepsy has yet to be determined. This thesis aims to study the roles of inflammation and epigenetic modulation in MTLE-HS. It questions whether the dysregulated inflammatory response in the brains of these patients is also reflected in their peripheral immune system or if their immune cells exhibit an altered response to stimuli. The primary focus is the analysis of the inflammatory response of peripheral monocytes through the miRNA levels quantification of key mediators involved in IL-1β synthesis, including P2X7R, TLR4, IL-1β, and NF-kB. Additionally, inflammation-associated miRs-146a and miR-22 will be quantified in both non-stimulated and LPS-stimulated conditions. As a secondary objective, the study aims to analyze the epigenetic modulation of the immune response in MTLE-HS patients. This involves quantifying epilepsy-associated miRNAs, such as miR-146a, miR-155, miR-132, and miR-134, in the serum of MTLE-HS patients and healthy controls. The potential diagnostic and prognostic value of these miRNAs will also be assessed. In LPS-stimulated conditions an increase of miR-146a was reported in Epileptic patients (EP)- derived monocytes comparing to non-stimulated monocytes (p <0.05). The same wasn’t verified in the control group, suggesting an altered activation towards an inflammatory stimulus in patients with epilepsy. The expression of pro-inflammatory mediators, in circulating monocytes, presented no significant differences between patients and controls. Circulating miR-134 levels were higher in patients comparing to controls (p<0.05), although its diagnostic value was low (AUC = 0.633). miR-132 exhibited higher levels in patients without a history of febrile seizures, suggesting its potential role in the mechanisms involved in the progression of disease (p<0.05). Although not statistically significant miR-146a levels were higher in patients with MTLE-HS than in controls. No other significant differences were observed. In conclusion, the results suggest that monocytes from patients with MTLE-HS are more prone to produce a dysregulated inflammatory response upon stimulation. Although the diagnostic/prognostic biomarker panel did not exhibit strong statistical power for clinical use, it highlighted the potential importance of miR-134 and miR-132, which could provide insights into the dysregulated mechanisms in epilepsy and serve as promising treatment targets. Since this is a preliminary study, future research should focus on characterizing molecular and phenotypically the activated monocytes. Additionally, quantifying the response of other immune cells such as macrophages and microglia is essential for a comprehensive understanding of the immune response in epilepsy and identifying potential triggers for the excessive inflammation observed in epilepsy.

A Epilepsia é uma doença neurológica que afeta 70 milhões de pessoas em todo o mundo. Nos adultos, a Epilepsia do Lobo Temporal Mesial com Esclerose do Hipocampo (MTLE-HS), é a forma de epilepsia refratária mais comum com mais de 80% dos doentes refratários ao tratamento farmacológico. Vários processos biológicos têm sido descritos como desregulados em epilepsia sendo que a neurotransmissão e neuroinflamação são descritos como os mais desregulados em toda as fases do processo epileptogénico. As crises epiléticas originam morte celular que por sua vez irá levar a ativação de fatores de transcrição e à expressão de citocinas pro-inflamatórias. Numa primeira fase estas citocinas pro-inflamatórias tais como a Interleucina-1β (IL-1β) são benéficas, promovendo a reparação do dano neuronal e a homeostasia celular. No entanto se esta resposta for exacerbada, estas citocinas tem a capacidade de interagir com neurotransmissores e canais iónicos alterando a sua função, promovendo a ocorrência de crises epiléticas. Doentes com MTLE-HS refratária apresentam uma sobre-expressão de IL-1β no hipocampo. Durante este processo inflamatório os monócitos em circulação no sangue periférico podem ser recrutados para o SNC. Estudos recentes descreveram uma subpopulação de monócitos, denominada “disease inflammatory macrophages” (DIMs), que são caracterizados pela sobre-expressão de citocinas pró-inflamatórias. Esta subpopulação celular foi descrita como estando expandida em epilepsia e pensa-se que pode contribuir para a exacerbação da neuroinflamação. Foi ainda observado que doentes epiléticos podem ter maiores níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias. No entanto, o contributo da resposta imune periférica para o desenvolvimento de epilepsia é ainda controverso. Assim o objetivo principal desta tese é estudar o papel da inflamação e da sua modulação epigenética em doentes com MTLE-HS, questionando se a resposta inflamatória alterada observada no cérebro de doentes, pode estar também alterada à periferia, ou se as células imunes periféricas exibem uma resposta alterada quando estimuladas. Para tal, níveis de expressão do miR-146a e do miR-22 serão analisados em monócitos não-estimulados e estimulados com LPS. Adicionalmente, a análise da expressão de mediadores envolvidos na síntese da IL-1β, que incluem o P2X7R, TLR4, IL-1β e o NF-kB será feita em monócitos periféricos. Como objetivo secundário, este estudo pretende também analisar a modulação epigenética envolvida na resposta imune em doentes com MTLE-HS, para tal serão analisados os níveis de expressão de miRNAs que têm sido associados à epilepsia tais como o miR-146a, miR-155, miR-132 e o miR-134 no soro de doentes com MTLE-HS e controlos saudáveis. O potencial diagnóstico e prognóstico destes miRNAs também será avaliado. Nos doentes, a expressão de miR-146a estava aumenta nos monócitos estimulados com LPS quando comparados com os monócitos não estimulados (p < 0.05). Tal não foi verificado no grupo de controlo, sugerindo uma ativação alterada em resposta a um estímulo inflamatório em doentes com epilepsia. A expressão de mediadores pró-inflamatórios em monócitos periféricos, não apresentou diferenças significativas entre doentes e controlos. Na análise ao soro, os níveis de miR-134 apresentaram um aumento significativo (p<0.05) nos doentes quando comparados com controlos. No entanto, o valor de diagnóstico deste miR era baixo (AUC = 0.633). O miR-132 apresentou um aumento significativo (p<0.05) dos níveis de expressão em doentes sem histórico de convulsões febris, sugerindo um potencial papel nos mecanismos envolvidos na progressão da doença. Apesar de os resultados não serem estatisticamente significativos, os níveis de expressão do miR-146a encontraram-se aumentados em doentes com MTLE-HS comparativamente com os controlos. Não foram observadas outras diferenças significativas. Em conclusão, estes resultados sugerem que os monócitos dos doentes com MTLE-HS têm uma predisposição para uma resposta inflamatória desregulada após um estímulo inflamatório. Embora o painel de biomarcadores de diagnóstico/prognóstico não apresente um bom poder estatístico para uso clínico, parece haver uma ligação entre os níveis do miR-134 e do miR-132, e mecanismos alterados na epilepsia. Tendo em consideração que este é um estudo preliminar, estudos futuros devem debruçar-se sobre a caracterização molecular e fenotípica de monócitos ativados, além disso também é importante quantificar a resposta noutras células envolvidas na resposta imunes como os macrófagos e a micróglia, permitindo assim uma melhor compreensão da relação entre resposta inflamatória e desenvolvimento / progressão de epilepsia.