Implementação e validação do método de deteção de DNA do alergénio de coco por real-time PCR

Abstract

As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública à escala global, afetando todas as faixas etárias, mas sobretudo as crianças. Uma alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre como resultado da presença de alergénios alimentares, que são erradamente identificadas como uma ameaça para o organismo pelo sistema imunitário. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar reações alérgicas em indivíduos suscetíveis, sendo a rotulagem um componente essencial para a identificação de alergénios nos alimentos, sendo também importante no que respeita à contaminação cruzada. Até ao momento, apenas alguns casos de alergias ao coco mediadas por imunoglobulina E (IgE) foram descritos na literatura. No entanto, devido ao crescente consumo de alimentos que contêm coco nos países ocidentais, o número de alergias a este também pode aumentar. O objetivo do presente trabalho foi implementar e validar o método de real-time PCR através de análises de sensibilidade, especificidade e limites de deteção para o alergénio de coco (Cocos nucifera) no laboratório de Biologia Molecular da ALS Life Sciences Portugal, S.A. Inicialmente, foram concebidos e testados três conjuntos de primers específicos e respetivas sondas e foi otimizada a reação de real-time PCR para identificar e quantificar DNA de coco. A especificidade dos primers foi testada e a reatividade cruzada excluída, através do teste com 54 outras espécies vegetais e animais. Numa série de diluições, foi determinado um LDPCR de 3,0x10-2 ng e um LDmétodo de 200 ppm, assim como uma eficiência da reação de 85%. Assim, o ensaio de real-time PCR é um método adequado para detetar coco em alimentos.

Food allergies are a major public health problem on a global scale, affecting all age groups, but especially children. A food allergy is an adverse reaction that occurs as a result of the presence of food allergens, which are wrongly identified as a threat to the body by the immune system. As it is a pathology that has no cure, prevention is the best way to avoid allergic reactions in susceptible individuals, and labeling is an essential component for identifying allergens in food, as well as being important about cross-contamination. To date, only a few cases of coconut allergies mediated by immunoglobulin E (IgE) have been described in the literature. However, due to the increasing consumption of foods containing coconut in Western countries, the number of coconut allergies may also increase. The aim of this work was to implement and validate the real-time PCR method by analyzing sensitivity, specificity, and detection limits for the coconut allergen (Cocos nucifera) in the Molecular Biology laboratory at ALS Life Sciences Portugal, S.A. Initially, three sets of specific primers and their probes were designed and tested, and the real-time PCR reaction was optimized to identify and quantify coconut DNA. The specificity of the primers was tested, and crossreactivity ruled out by testing with 54 other plant and animal species. In a dilution series, an LDPCR of 3.0x10-2 ng and a LDmethod of 200 ppm were determined, as well as a reaction efficiency of 85%. Thus, the real-time PCR assay is a suitable method for detecting coconut in food.