From caves to the deep sea: revealing the treasures of actinomycetes in extreme environments

Abstract

The emergence of antimicrobial resistance, along with the absence of new antibiotic discoveries, presents a major global health challenge in the 21st century, as multidrug-resistant bacterial strains have become common in hospitals. Actinobacteria stand out as a promising source for novel antibiotics since this diverse group of bacteria is known to produce a wide range of bioactive compounds, notably characterized by a significant prevalence of antimicrobial agents. Actinobacteria inhabiting extreme environments exhibit significant taxonomic and genetic diversity, offering great potential for the discovery of new biosynthetic pathways for synthesizing bioactive compounds. This work focuses on the study of actinobacteria derived from extreme environments, namely from the deep sea and caves, in terms of their biodiversity and capacity to produce novel antimicrobial compounds. The One Strain Many Compounds (OSMAC) approach represents a promising strategy unlocking dormant biosynthetic gene clusters and discovering new natural compounds. In the first study presented in this thesis, four OSMAC conditions were applied to seven actinobacterial strains previously isolated from deep-sea samples collected at the Azores and Madeira archipelagos, with the objective of investigating if these conditions could trigger the production of potentially novel antimicrobial compounds. These conditions included the addition to the culture medium of: i) an E. coli lysate; ii) the supernatant resulting from E. coli growth; iii) a solution of N-acetylglucosamine and iv) a solution of lanthanum (III) chloride. The extracts resulting from the OSMAC approach were tested for their antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 25241) and Candida albicans (ATCC 10231). The antimicrobial assay allowed the identification of an extract from Streptomyces xinghaiensis C_003.1.9 grown under no OSMAC condition, capable of inhibiting the growth of S. aureus and B. subtilis. The actinobacterial extracts were subjected to metabolomic analyses, including mass spectrometry-based dereplication and molecular networking analyses. These results revealed the presence of eleven known natural compounds with pharmaceutical relevance and a possible new compound, from the extract of Microbacterium ginsengiterrae C_014 6 (major compound m/z 747.304), obtained under the addition of N-acteylglucosamine solution. The results obtained reassure the need to continue this study, ensuring if genuinely novel compounds are being synthesized, and advancing towards the subsequent stage for the chemical elucidation of these compounds. The second study presented in this thesis aimed at the isolation and taxonomic identification of actinobacteria from the Vjetrenica Cave, in Bosnia-Herzegovina. A total of 111 actinobacterial isolates were obtained, using SCN and TWYE as selective culture media. Eleven different genera were identified, with the largest fraction of isolates belonging to the Streptomyces genus. This study also led to the identification of three possible novel strains of the genera Streptomyces and Sphaerisporangium. These results suggest that caves are an excellent source of actinobacteria, including novel taxonomies, and are an excellent environment for the exploration of novel bioactive compounds produced by these microorganisms.

O surgimento da resistência antimicrobiana, juntamente com a ausência de novas descobertas de antibióticos, apresenta um importante desafio para a saúde global no século XXI, à medida que estirpes bacterianas multirresistentes se tornaram comuns em hospitais. As actinobactérias destacam-se como uma fonte promissora de novos antibióticos, uma vez que este diverso grupo de bactérias é conhecido por produzir uma vasta gama de compostos bioativos, com uma especial prevalência de agentes antimicrobianos. As actinobactérias que habitam ambientes extremos exibem uma diversidade taxonómica e genética significante, oferecendo grande potencial para a descoberta de novas vias biossintéticas para a síntese de compostos bioativos. Este trabalho foca-se no estudo de actinobactérias provenientes de ambientes extremos, especificamente do mar profundo e de grutas, em termos da sua biodiversidade e capacidade para produzir novos compostos antimicrobianos. A abordagem OSMAC, que significa uma estirpe muitos compostos, representa uma estratégia promissora para desbloquear clusters de genes biossintéticos adormecidos e descobrir novos compostos naturais. No primeiro estudo apresentado nesta tese, quatro condições OSMAC foram aplicadas a sete estirpes de actinobactérias previamente isoladas de amostras de mar profundo dos arquipélagos dos Açores e Madeira, com o objetivo de investigar se essas condições poderiam despoletar a produção de compostos antimicrobianos potencialmente novos. Essas condições incluíram a adição ao meio de cultura de: i) um lisado de E. coli; ii) sobrenadante resultante do crescimento de E. coli; iii) uma solução de N-acetilglucosamina; e iv) uma solução de cloreto de lantânio (III). Os extratos resultantes da abordagem OSMAC foram testados quanto à sua atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 25241) e Candida albicans (ATCC 10231). O ensaio antimicrobiano permitiu identificar um extrato de Streptomyces xinghaiensis C_003.1.9 cultivado sem condição OSMAC, capaz de inibir o crescimento de S. aureus e B. subtilis. Os extratos de actinobactérias foram submetidos a análises metabólicas, incluindo a desreplicação baseada em espectrometria de massa e análise de redes moleculares. Estes resultados revelaram a presença de onze compostos naturais conhecidos com relevância farmacêutica e um possível novo composto, no extrato de Microbacterium ginsengiterrae C_014 6 (principal composto m/z 747.304), obtido com a adição de uma solução de N-acetilglucosamina. Os resultados obtidos reforçam a necessidade de continuar este estudo, garantindo se estão sendo sintetizados compostos genuinamente novos, e avançando para a etapa subsequente de elucidação química destes compostos. O segundo estudo apresentado nesta tese teve como objetivo o isolamento e a identificação taxonómica de actinobactérias provenientes da gruta de Vjetrenica, na Bósnia-Herzegovina. Foram obtidos 111 isolados de actinobactérias, utilizando os meios seletivos de cultura SCN e TWYE. Onze géneros diferentes foram identificados, com a maior representatividade de isolados pertencendo ao género Streptomyces. Este estudo também identificou três possíveis novas estirpes pertencentes aos géneros Streptomyces e Sphaerisporangium. Esses resultados sugerem que as grutas são uma excelente fonte de actinobactérias, incluindo novas taxonomias, e um excelente ambiente para a exploração de novos compostos bioativos produzidos por estes microrganismos.