Single and combined effects of sertraline and polyhydroxybutyrate nanoplastics to amphibians: an in vitro and in vivo approach

Abstract

Pollution stands as a major factor affecting wildlife populations, with amphibians being an exceptionally vulnerable group. Plastic pollution, particularly of nanoplastics (NPs) originated from primary and secondary sources, gains relevance owing to its distinctive characteristics, including its minute size, large surface area (relatively to the volume), and heightened surface reactivity. As the demand for more sustainable alternatives to conventional plastics intensifies, the emergence of polyhydroxybutyrate (PHB) as a novel bio-based and biodegradable plastic stands out. However, the understanding of its possible environmental impacts, particularly regarding its nanosized particles, remains limited. These particles possess the potential to exert pernicious effects and act as carriers for environmental contaminants into biota. Sertraline, one of the most consumed antidepressants, is already present in the aquatic environment due to patient excretion, inefficient wastewater treatment, and improper disposal. Given its bioactive nature, even low concentrations of sertraline may pose undesirable effects on biota. The main objectives of this work were: (i) to assess the toxicity of PHB nanoplastics and sertraline, in single and combined exposure, towards two aquatic early life stages of the model organism Xenopus laevis. (ii) Additionally, in vitro assays were conducted to understand the suitability of two cell lines as non-animal alternatives to be used in first tiers of environmental risk assessment for this type of contamination. To attain these objectives, both embryos and tadpoles of X. laevis were exposed for 96-h to increasing concentrations of sertraline and PHB-NPs, as well as combined (only for tadpoles) exposures, where the endpoints assessed were mortality, occurrence of malformations, heart rate and growth (body length and body weight, the later endpoint only for tadpoles). On the other hand, 72-h cytotoxic assays were conducted with two cell lines derived from X. laevis (A6 and XTC-2), where the cell viability was assessed through the MTT and resazurin viability assays Our results suggested high tadpole sensitivity to sertraline (96-h LC50: 0.45 mg L-1), when compared to embryos (96-h LC50: 2.58 mg L-1), while concentrations of PHB-NPs between 0.01 and 100 μg L-1 did not show statistically differences in the monitored endpoints. Furthermore, A6 and XTC-2 cell lines were less sensitive to sertraline with 72-h LC50 of 5.05 and 3.78 mg L-1, respectively, while the opposite was observed for the PHB-NPs, however, the NOEC values (i.e., 3.65 and 18.25 mg L-1 for XTC-2 and A6, respectively) suggest that the sensitivity threshold was far superior than the tested concentrations on in vivo. PHB-NPs and sertraline co-exposure showed no apparent interaction on in vivo assays, while on in vitro assays both examples of antagonism and synergism were observed. Our results suggest that amphibians are more sensitive to sertraline than fish, that work as surrogates for amphibians in environmental risk assessment. On the other hand, cell lines, though not being more sensitive than tadpoles and embryos to sertraline, seemed to be good alternatives for animal testing, promoting fast and reliable preliminary assays, and allow a more precise selection of concentration ranges to be tested at later phases of environmental risk assessment, consequently reducing the number of organisms used in animal testing.

A poluição assume-se como um fator significativo que afeta as populações da vida selvagem, sendo os anfíbios um grupo particularmente vulnerável. A poluição por plásticos, em particular por nanoplásticos (NPs) provenientes de fontes primárias e secundárias, ganham destaque devido às suas características distintas, tais como o seu pequeno tamanho, elevada área superficial (relativamente ao volume) e reatividade. À medida que a procura por alternativas mais sustentáveis aos plásticos convencionais aumenta, destaca-se a emergência do polihidroxibutirato (PHB) como um novo plástico de base biológica e biodegradável. No entanto, o conhecimento sobre o seu possível impacto ambiental, em particular no que diz respeito às partículas de tamanho nano, permanece limitado. Estas partículas possuem o potencial para exercer efeitos prejudiciais e atuar como transportadoras de contaminantes ambientais para a biota. A sertralina, um dos antidepressivos mais consumidos a nível mundial, encontra-se a presente no ambiente aquático devido à excreção pelos pacientes, através por exemplo da urina, do tratamento ineficaz de águas residuais e eliminação imprópria. Dada a sua natureza bioativa, mesmo baixas concentrações de sertralina podem ter efeitos indesejáveis na biota. Neste contexto, os principais objetivos deste trabalho foram: (i) avaliar a toxicidade de nanoplásticos de PHB e da sertralina, em exposição única e combinada, em duas fases iniciais do desenvolvimento da espécie modelo Xenopus laevis; (ii) compreender a adequabilidade de metodologias in vitro (utilizando duas linhas celulares derivadas de X. laevis: A6 e XTC-2) como alternativas não animais a serem utilizadas nas fases iniciais de análise de risco de contaminação química em fases de vida aquáticas de anfíbios. De modo a alcançar estes objetivos, embriões e girinos de X. laevis foram expostos por 96-h concentrações crescentes de sertralina e PHB-NPs e em mistura (apenas girinos), onde foram avaliados mortalidade, ocorrência de malformações, ritmo cardíaco e crescimento (comprimento do corpo e peso, sendo o último apenas aplicável para girinos). Por outro lado, foram realizados ensaios de 72-h com linhas celulares derivadas de X. laevis, onde as suas viabilidades celulares foram medidas através do ensaio de MTT e resazurina. Os resultados obtidos sugerem uma elevada sensibilidade de girinos a sertralina (LC50 de 96-h: 0,45 mg L-1), em comparação com os embriões (LC50 de 96-h: 2,58 mg L-1), enquanto concentrações de NPs de PHB entre 0.01 e 100 μg L-1 não apresentaram efeitos significativos nos parâmetros monitorizados nestes dois estádios de vida. No que respeita aos ensaios in vitro as linhas celulares A6 e XTC-2 foram menos sensíveis à sertralina, com LC50 de 72-h de 5,05 e 3,78 mg L-1, respetivamente, enquanto o oposto foi observado para os NPs de PHB, com LC50 de 72-h de 6,13 e 3,89 mg L-1 e valores de NOEC de 3,65 e 18.24 mg L-1, respetivamente. Os valores de NOEC indicam que os intervalos de sensibilidade de ambas as linhas celulares são bastante superiores às concentrações testadas in vivo. Os ensaios in vivo realizados com a misturas de PHB-NPs e sertralina não evidenciaram interação entres os dois xenobióticos na toxicidade observada in vivo, enquanto nos ensaios in vitro foram observados efeitos sinergéticos e antagónicos entre a sertralina e PHB-NPs. Os nossos resultados sugerem que os anfíbios são mais sensíveis à sertralina do que os peixes, que têm um papel de substituto dos anfíbios em avaliações de risco ecológico. Por outro lado, as linhas celulares, apesar de serem menos sensíveis para a sertralina do que os girinos e embriões, demonstraram potencial como alternativas não animais, promovendo ensaios preliminares rápidos e confiáveis, permitindo uma seleção mais precisa das gamas de concentração a testar em fases mais avançadas de avaliação de risco ecológico, consequentemente reduzindo o número de organismos usados em experimentação animal.