Transformação de uma bactéria promotora de crescimento com GFP para estudos de colonização da raiz de Olea europaea

Abstract

Plant growth-promoting bacteria (PGPB) are a group of beneficial bacteria that associate with plants and promote their growth. This interaction has the potential to reduce crops' dependence on agrochemicals. However, it is crucial to determine whether a particular PGPB strain can effectively inoculate a candidate host plant in order to develop PGPB-based biostimulants. The aim of this study was to develop a fluorescence-tagged PGPB strain (Pseudomonas oryzihabitans RL18) for monitoring root colonization. RL18 was transformed with the pMF230 plasmid, which allows for constitutive expression of GFP. The successful construction of the RL18gfp strain was confirmed by testing for antibiotic resistance, and observing fluorescence emission from colonies and cells under UV light. Young Olea europaea plants' roots were inoculated by immersion in RL18gfp cell suspensions, and the inoculated plants were cultivated for 8 weeks in simulated field conditions. Fluorescence was used to monitor the kinetics of the initial adsorption of cells to the rhizoplane and to infer the colonization of the root endosphere. Visual inspection of the roots under UV light allowed the establishment of a 2- hour duration for the inoculation (immersion) step. The observation by fluorescence microscopy of thin cuts obtained biweekly from cultivated plants confirmed the persistence of the inoculum on outer tissues of the root, but the interference of auto-fluorescence precluded the accurate characterization of the kinetics of colonization on the root endosphere.

As bactérias promotoras de crescimento de plantas (plant-growth promoting bacteria, PGPB) são um grupo de bactérias benéficas que se associam às plantas e promovem o seu crescimento. Esta interação entre PGPB e plantas, tem o potencial de poder contribuir para reduzir a dependência da agricultura em relação aos agroquímicos. No entanto, determinar se uma determinada estirpe de PGPB pode colonizar eficazmente uma planta hospedeira é um passo crucial no desenvolvimento de bioestimulantes baseados em PGPB. Este estudo teve como objetivo desenvolver uma PGPB-modelo (Pseudomonas oryzihabitans RL18) marcada com fluorescência, para monitorar o processo de colonização da raiz. A bactéria nativa (RL18) foi transformada com o plasmídeo pMF230 que permite a expressão constitutiva de GFP. A construção bem-sucedida da estirpe RL18gfp foi confirmada por testes de resistência a antibióticos, e observação da emissão de fluorescência de colónias e células sob luz UV. As raízes de plantas (Olea europaea) jovens de foram inoculadas com a bactéria transformada, por imersão em suspensões de células RL18gfp. As plantas inoculadas foram cultivadas durante 8 semanas em condições de campo simuladas. A fluorescência foi utilizada como sinal para monitorizar a cinética da adsorção inicial das células ao rizoplano e para inferir da colonização da endosfera radicular. A inspeção visual das raízes sob luz UV permitiu estabelecer uma duração de 2 horas para a etapa de inoculação (imersão). A observação por microscopia de fluorescência de cortes finos, obtidos quinzenalmente de plantas cultivadas, confirmou a persistência do inóculo nos tecidos externos da raiz, mas a interferência da autofluorescência impossibilitou a caracterização mais exata da cinética de colonização na endosfera da raiz.