Effects of L-Carnitine on viability and proliferation of somatic sertoli cells

Abstract

Male infertility can arise due to the influence of reactive oxygen species (ROS) overwhelming in the testis or spermatozoa. This state of imbalance results in Oxidative Stress (OS), triggering lipid peroxidation which subsequently inflicts harm upon sperm cells. To counteract this detrimental process, the application of antioxidants like LCarnitine (LC) proves to be effective. LC, a supplement commonly embraced by athletes to diminish fatigue, enhance performance, and expedite post-exercise recovery, exhibits the capacity to mitigate OS and safeguard sperm from impairment. The genesis of male infertility spans a multitude of origins and is frequently rooted in the intricate process of spermatogenesis, where the pivotal task of producing and maturing sperm cells unfolds. Disruptions within this critical process invariably cast a shadow over male fertility. An essential component of this process is the Sertoli cells (SCs), specialized cells that play an indispensable role in nurturing and supporting the progression of developing sperm cells. As spermatogonia transition through diverse stages of maturation, SCs provide a distinctive and nurturing environment crucial to their evolution. In this study we aimed to investigate the potential effects of LC on somatic SCs. For this purpose, a TM4 cell line, a mouse Sertoli-like line, was used. SCs cultures (n=5 for each condition) were maintained for a 24-hour period, both in the absence and presence of L-Carnitine (LC): 0.005, 0.05, 0.5, and 5 mM. The concentration of 0.05 mM was chosen as it aligns with the levels detected in the peripheral circulation of athletes’ post-consumption of LC. Then, the cytotoxic impact of LC on SCs was assessed through multiple assays. The assays employed included Sulforhodamine B (SRB) staining, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, and the measurement of lactate dehydrogenase (LDH) release. The oxidative damage was analyzed by slot blot technique (levels of lipid peroxidation, protein nitration, and protein carbonylation). The mitochondrial function was also assessed by determining the mitochondrial complexes expression level (Total OXPHOS) and the mitochondrial membrane potential (JC-1 assay). Finally, levels of ROS and the total media antioxidant capacity were measured using the fluorogenic dye CM-H2DCFDA and FRAP assay, respectively. SCs presented increased cell proliferation and viability after exposure to 0.05 mM of LC compared to the control but no OS-related damages were detected. Indeed, media supplemented with LC showed no ROS overproduction. Exposure of SCs to LC showed a notable preservation of mitochondrial integrity, with the mitochondria remaining unaffected. Furthermore, a discernible enhancement after SCs exposure to 0.05 mM L-Carnitine concentration was observed in complex V (ATP synthase) expression when compared with 0.005 mM concentration. The supplementation to LC at a concentration of 0.05 mM exhibited a noteworthy reduction of ROS and an increase in its total antioxidant capacity. These findings suggest a promising beneficial effect of LC on SCs, as observed at a concentration mirroring that which circulates in the plasma of athletes following LC consumption. Nonetheless, it remains imperative to conduct additional research to firmly establish the potential advantages of LC for enhancing male fertility, as well as to unravel the precise mechanisms underlying its mode of action.

A infertilidade masculina pode ser originada por um aumento das espécies reativas de oxigénio (ERO) nos testículos ou nos espermatozóides, levando a um desequilíbrio entre os ERO e as defesas antioxidantes. Esta instabilidade resulta em stress oxidativo (SO), e num aumento da peroxidação lipídica, o que consequentemente, inflige danos nos espermatozóides. Para contrariar este processo prejudicial, a aplicação de antioxidantes como a L-Carnitina (LC) revela-se eficaz. A LC é um suplemento alimentar usado normalmente por atletas profissionais para diminuir a fadiga, melhorar a performance e ajudar na recuperação pós exercício físico. Além disso, exibe também a capacidade de atenuar o SO e proteger os espermatozóides. A infertilidade masculina é causada por diversos fatores e está frequentemente ligada à espermatogénese, onde ocorre a produção e maturação dos espermatozóides. Perturbações neste processo inevitavelmente afetam a fertilidade masculina, destacando a importância da espermatogénese na fertilidade e na reprodução. As células de Sertoli, células especializadas que desempenham um papel indispensável na nutrição e apoio à progressão dos espermatozóides em desenvolvimento, são um componente essencial deste processo. À medida que as espermatogónias passam por diversas fases de maturação, as células de Sertoli proporcionam um ambiente único e nutritivo, crucial para a sua evolução. Este estudo teve por objetivo investigar os potenciais efeitos da LC nas células de Sertoli (CS). Para esse efeito, foi usada uma linha celular de células de Sertoli de rato (linha celular TM4). A cultura de CS (n=5 para cada condição) foi mantida durante um período de 24 horas, tanto na ausência como na presença de LC: 0.005, 0.05, 0.5 e 5 mM. Foi selecionada a concentração de 0.05 mM por se assemelhar aos níveis detetados na circulação periférica de atletas após o consumo de LC. Primeiramente, o impacto citotóxico da LC nas CS foi avaliado através de vários ensaios, incluindo coloração com Sulforodamina B (SRB), ensaio com brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e medição da libertação de lactato desidrogenase (LDH). O dano oxidativo foi analisado pela técnica de slot blot (níveis de peroxidação lipídica, nitração e carbonilação de proteínas). A função mitocondrial foi avaliada através da determinação do nível de expressão dos complexos mitocondriais (Total OXPHOS) e do potencial de membrana mitocondrial (ensaio JC-1). Por fim, os níveis de ROS e a capacidade antioxidante total do meio foram medidos, utilizando o corante fluorogénico CM-H2DCFDA e o ensaio FRAP, respetivamente. As CS apresentaram um aumento da proliferação e viabilidade celular após exposição a 0.05 mM de LC em comparação com o controlo, mas não foram detetados danos relacionados com o SO. De facto, os meios suplementados com LC não apresentaram produção excessiva de ROS. A exposição à LC mostrou uma notável preservação da integridade mitocondrial, com as mitocôndrias a permanecer inalteradas. Além disso, foi observado um aumento significativo na concentração de 0.05 mM de LC na expressão do complexo V (ATP sintase) quando comparado com a concentração de 0.005 mM. A administração de LC na concentração de 0.05 mM resultou numa redução de ROS, e no aumento da sua total capacidade antioxidante. Estes resultados sugerem um efeito benéfico promissor da LC nas CS, conforme observado na concentração semelhante à que circula no plasma de atletas após o consumo de LC. No entanto, continua a ser muito importante realizar mais estudos com vista a estabelecer as potenciais vantagens da LC para melhorar a fertilidade masculina, bem como para entender os mecanismos precisos subjacentes ao seu modo de ação.