Molecular and metabolic pathways for endocrine-disrupting chemicals action in male fertility: focus on atrazine

Abstract

In the last half-century sperm quality has been declining globally. Although its causes remain elusive, it is suggested that alterations in environmental conditions and increased exposure to industrial and pharmaceutical chemicals play a key role due to their capacity as endocrine-disrupting chemicals (EDCs). EDCs are ubiquitous in our daily lives, being present in our environment, food, and consumer products. Atrazine (ATZ) is a pesticide listed as a potent EDC, capable of causing a variety of negative health outcomes, including decreased testosterone production, delayed puberty, and infertility. However, our understanding of the influence of ATZ on testicular metabolism remains limited. Within the male reproductive tract, somatic Sertoli cells (SCs) act as sentinels and regulate spermatogenesis. Thus, we hypothesized that ATZ may alter the function of SCs and consequently affect spermatogenesis. Herein we aimed to study the effects of environmentally relevant concentrations of ATZ on the metabolic and mitochondrial function of SCs. For this, mouse SCs (mSCs) were exposed to increasing concentrations of ATZ (0.3, 3, 30, 300 and 3000 μg/L) for 24h at 37°C. ATZ concentrations were selected based on concentrations found in human occupational exposure (0.3 μg/L), the legal limit of ATZ in drinking water (3 and 30 μg/L), and concentrations found in soils and rivers near agricultural crops where ATZ was used (300 and 3000 μg/L). After incubation, cytotoxicity was studied by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and lactate dehydrogenase (LDH) release assays. Cellular proliferation was assessed by sulforhodamine B (SRB) assay. Mitochondrial activity and endogenous reactive oxygen species (ROS) production were evaluated using JC-1 and CM-H2DCFDA probe, respectively. The ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay was used to measure the antioxidant potential of culture media. Protein levels of LDH were analyzed using Western Blot and the mSCs glycolytic function using the Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit. Metabolites in the culture media were identified and quantified by the Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) technique. Our findings provide compelling evidence that ATZ exposure led to a notable reduction in the metabolic activity of mSCs at all tested concentrations, without inducing cytotoxicity. Despite existing reports indicating that ATZ can induce oxidative stress, our study did not reveal any significant changes in mitochondrial function or ROS production in mSCs. ATZ exposure significantly impaired mSCs glycolysis and glycolytic capacity, at all tested concentrations. These findings were further corroborated by a decrease in the expression of LDH. Interestingly, glucose and pyruvate consumption, and acetate and lactate production were unaffected by ATZ exposure. In this study, we present, for the first time, evidence that ATZ exerts a detrimental effect on the metabolic activity of mSCs, without altering cell viability and proliferation. This discovery underscores the need for future studies to unravel the intricate mechanisms through which ATZ operates and to gain a deeper understanding of how it may disrupt the crucial nutritional support required for spermatogenesis.

No último meio século, a qualidade espermática tem diminuído a nível global. Embora as causas permaneçam indefinidas, sugere-se que as alterações nas condições ambientais e o aumento da exposição a produtos químicos industriais e farmacêuticos desempenhem um papel fundamental devido à sua capacidade como produtos químicos desreguladores endócrinos (EDC). Os EDCs são onipresentes nas nossas vidas diárias, estando presentes no meio ambiente, nos alimentos e em produtos de consumo. A atrazina (ATZ) é um pesticida listado como um potente EDC, associada a uma variedade de efeitos pejorativos para a saúde, incluindo diminuição da produção de testosterona, atraso na puberdade e infertilidade. No entanto, a nossa compreensão da influência da ATZ no metabolismo testicular permanece limitada. No âmbito do trato reprodutor masculino, as células somáticas de Sertoli (SCs) atuam como sentinelas e regulam a espermatogénese. Assim, colocou-se a hipótese de que a ATZ pode alterar a função das SCs e consequentemente afetar a espermatogénese. Este trabalho, teve por objetivo estudar os efeitos de concentrações ambientalmente relevantes de ATZ na função metabólica e mitocondrial das SCs. Para tal, SCs de ratinho (mSCs) foram expostas a concentrações crescentes de ATZ (0,3, 3, 30, 300 e 3000 μg/L) durante 24h a 37°C. As concentrações de ATZ foram selecionadas com base nas encontradas na exposição ocupacional humana (0,3 μg/L), no limite legal de ATZ na água potável (3 e 30 μg/L) e nas concentrações encontradas em solos e rios próximos a culturas agrícolas nas quais a ATZ foi utilizada (300 e 3000 μg/L). Após a incubação, a citotoxicidade foi estudada pelos ensaios de 3-(4,5-Dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio brometo (MTT) e libertação de lactato desidrogenase (LDH). A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de sulforhodamina B (SRB). A atividade mitocondrial e a produção endógena de espécies reativas de oxigénio (ROS) foram avaliadas usando as sondas JC-1 e CM-H2DCFDA, respetivamente. O ensaio do poder antioxidante redutor férrico (FRAP) foi utilizado para medir o potencial antioxidante dos meios de cultura. Os níveis de proteína de LDH foram analisados usando Western Blot e a função glicolítica dos mSCs usando o Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit. Os metabolitos presentes nos meios de cultura foram identificados e quantificados pela técnica de Ressonância Magnética Nuclear (1H-RMN). Os nossos resultados fornecem evidências convincentes de que a exposição à ATZ levou a uma redução notável na atividade metabólica das mSCs em todas as concentrações testadas, sem induzir citotoxicidade. Apesar de existirem relatos que a ATZ pode induzir stress oxidativo, o presente estudo não revelou quaisquer alterações significativas na função mitocondrial ou na produção de ROS nas mSCs. A exposição à ATZ prejudicou significativamente a glicólise e a capacidade glicolítica das mSCs, em todas as concentrações testadas. Estes resultados foram ainda corroborados por uma diminuição na expressão de LDH. Curiosamente, o consumo de glucose e piruvato e a produção de acetato e lactato não foram afetados pela exposição à ATZ. Neste estudo, apresentamos, pela primeira vez, evidências de que a ATZ exerce um efeito prejudicial na atividade metabólica das mSCs, sem alterar a viabilidade e proliferação celular. Estas descobertas evidenciam a necessidade de estudos futuros focados em desvendar os mecanismos através dos quais a ATZ atua e para uma compreensão mais profunda de como ela pode perturbar o suporte nutricional crucial para a espermatogénese.