Exploring axonal transport and microtubule defects in transthyretin amyloid polyneuropathy (ATTR-PN)

Abstract

Transthyretin Amyloid Polyneuropathy (ATTR-PN) is a rare, fatal neurodegenerative disease characterized by the deposition of mutant transthyretin (TTR) aggregates in the peripheral nervous system (PNS), leading to sensory axonopathy. Existing therapies do not address the irreversible neurodegeneration characteristic of this disease, highlighting the need for further understanding of ATTR-PN pathogenesis. This study investigated how mutant TTR affects the axonal cytoskeleton, particularly microtubule dynamics and axonal transport, known early markers of peripheral neuropathies. Specifically, we performed confocal live imaging of the sural nerve axons from hTTRᴬ⁹⁷S mice, an ATTR-PN mouse model with sensory impairment, to measure microtubule dynamics, by crossing the model with transgenic mice expressing green fluorescent protein-tagged EB3 (Thy1:EB3-GFP), and mitochondrial transport, by crossing the model with transgenic mice expressing red-fluorescent mitochondria (Thy1-MitoRFP). Our data revealed an increase in EB3 comet density, indicating microtubule instability, and impaired axonal transport, as determined by a decrease in the percentage of motile mitochondria and respective velocity, in hTTRᴬ⁹⁷S axons. Notably, these defects were present at an age preceding axonal loss. Additionally, sural nerve proteomics revealed alterations in molecular pathways related to actin and synapse organization in hTTRᴬ⁹⁷S mice. Building upon these findings, and as actin dysfunction in ATTR-PN was previously addressed, we investigated the axonal transport of synaptophysin (SYP) and the levels and distribution of the presynaptic marker synaptotagmin-2 ( molecular markers of presynaptic vesicle membranes, in hTTRᴬ⁹⁷S dorsal root ganglion (DRG) sensory neurons. We observed a notable impairment in SYP vesicle transport and a significant reduction in SYT2 in mutant neurons. Overall, we demonstrate for the first time that sensory axons from an ATTR-PN mouse model present microtubule instability, impaired transport of mitochondria and of presynaptic structures preceding the onset of neurodegeneration, which might relate to the proteomic results revealing dysregulation in the actin cytoskeleton and synapse organization. Nonetheless, the exact molecular mechanisms underlying these alterations require further research. Our findings offer new insights into axonal degeneration in ATTR-PN, paving the way for potential therapeutic targets.

A Polineuropatia Amiloidótica por Transtirretina (ATTR-PN) é uma doença neurodegenerativa rara e fatal caracterizada pela deposição de agregados de transtirretina mutada (TTR) no sistema nervoso periférico, resultando numa axonopatia sensitiva. As terapias existentes não abordam a neurodegeneração irreversível característica da doença, destacando-se a necessidade de uma melhor compreensão da patogénese da ATTR-PN. O presente estudo teve o objetivo de investigar de que forma a TTR amiloidogénica afeta o citoesqueleto axonal, especificamente a dinâmica dos microtúbulos e o transporte axonal, conhecidos como marcadores precoces de axonopatias. Especificamente, foi filmado por microscopia confocal o nervo sural de murganhos hTTRᴬ⁹⁷S, um modelo animal de ATTR-PN com deficiências sensitivas, para medir a dinâmica dos microtúbulos, através do cruzamento do modelo com murganhos transgénicos que expressam a proteína EB3 marcada com a proteína fluorescente verde (Thy1:EB3-GFP), e o transporte mitocondrial, através do cruzamento do modelo com murganhos transgénicos que expressam mitocôndrias marcadas com proteína fluorescente vermelha (Thy1-MitoRFP). Os nossos resultados revelaram um aumento na densidade de cometas EB3, o que indica uma potencial instabilidade dos microtúbulos, e o transporte axonal comprometido, determinado pela diminuição da percentagem de mitocôndrias móveis e das suas respetivas velocidades, nos axónios sensitivos dos murganhos hTTRᴬ⁹⁷S. Notavelmente, estes defeitos revelaram-se numa idade anterior à perda axonal. Além disso, a análise da proteómica do nervo sural revelou alterações em vias moleculares relacionadas com o citoesqueleto de actina e com organização de sinapses. Desta forma, e uma vez que a disfunção da actina em ATTR-PN foi previamente explorada, investigamos o transporte de sinaptofisina (SYP) e os níveis e distribuição de sinaptotagmina-2 (SYT2), marcadores da membrana de vesículas présinápticas, em neurónios sensitivos dos gânglios da raiz dorsal (DRG) dos hTTRᴬ⁹⁷S. Observamos alterações significativas no transporte das vesículas de SYP e uma redução de SYT2 nos neurónios mutantes. Resumindo, demonstramos pela primeira vez que os axónios sensitivos de um modelo de ATTR-PN apresentam instabilidade dos microtúbulos, defeitos no transporte intracelular de mitocôndrias e em estruturas presinápticas, que ocorrem precedentes à neurodegeneração, o que pode estar relacionado com os resultados da proteómica que revelam desregulação no citoesqueleto de actina e na organização sináptica. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a estas alterações requerem investigação adicional. O nosso estudo apresenta novas perspetivas sobre a neurodegeneração em ATTR-PN, abrindo caminho para potenciais alvos terapêuticos.