Mial (microalgae lipids) - exploitation of microalgae lipidome: a lipidomics strategy to bioprospect bioactive phytochemicals

Abstract

The production of food systems can be affected by Climate Change (CC), reducing food accessibility and nutritional quality, which in turn can cause malnutrition and the increase incidence of non-communicable diseases (NCD). Microalgae are potential alternatives as novel food, as they are sustainable and versatile resources, which have been consumed by humans for centuries. Microalgae are rich in essential nutrients tackling nutritional deficits that predispose individuals to NCD and have a wide and diverse set of bioactive phytochemicals providing important health benefits. Polar lipids carrying n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) are among the algae phytochemicals that have been recently regarded for their bioactive properties, with health-promoting benefits and the potential to prevent NCD. However, the lack of knowledge of the lipidome of microalgae, the absence of studies on the structural characterization of bioactive lipids and the mechanisms involved in their bioactive properties impair the full exploitation of microalgae lipids. The main objectives of this thesis were to perform the identification of the lipidome of commercialized and novel microalgae using state-of-the-art lipidomic approaches based on mass spectrometry analysis, to produce and characterize lipid extracts obtained with green and sustainable approaches, to understand the plasticity of the microalgae lipidome with different cultivation conditions, and to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory properties of microalgae lipids. To achieve these goals, we performed an identification of the fatty acid (FA) profile by gas-chromatography mass spectrometry (GC-MS), assessed the lipid quality indexes and antioxidant activity of seven different microalgae species (Chlorella vulgaris, Chlorococcum amblystomatis, Nannochloropsis oceanica, Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus obliquus, Spirulina sp. and Tetraselmis chui) performed the first in-depth characterization of the lipidome of two microalgae species from phylum Chlorophyta (C. amblystomatis and Tetraselmis striata) through liquid-chromatography high-resolution mass spectrometry (LC-MS), and assessed the in vitro anti-inflammatory properties of C. amblystomatis and N. oceanica lipids. The studied microalgae exhibited a species-specific FA profile and a specific n-3 PUFA composition but with species of the same phylum showing few similar tendencies. Microalgae from Chlorophyta phylum were characterized by higher amounts of α-linolenic acid (ALA), while Ochrophyta and Bacillariophyta had higher amounts of eicosapentaenoic acid (EPA). The Scenedesmus obliquus showed the highest content in n-3 PUFA while Spirulina sp. showed no content in these FA. All microalgae lipids showed low nutritional indexes revealing health-beneficial properties. The different lipid extracts showed similar antioxidant activities, with a higher activity associated with the extracts of S. obliquus and C. vulgaris. The antioxidant activity showed a positive correlation with the PUFA content. The identification of the lipidome of C. amblystomatis for the first time allowed to assign 350 polar lipid species distributed by different classes of glycolipids (GL), betaine lipids and phospholipids (PL), of which 157 were esterified to n-3 PUFA, such as α-linolenic acid (ALA) and eicosapentaenoic acid (EPA), and some previously reported with bioactive potential. Using ultrasound-assisted extraction (UAE) with ethanol (EtOH) a green solvent, we obtained food-grade extracts enriched with polar lipid-rich extracts of C. amblystomatis. Also, we obtained similar yields of extraction compared to conventional extraction methods using chlorinated solvents. Lipidomic analysis showed that lipid extracts obtained with UAE had a similar profile and yield of polar lipids rich in n-3 PUFA. The lipidome of T. striata CPT4 was also studied, and we identified 82 PL, 105 GL, 37 betaine lipids and 82 neutral lipids. Lipidomics approaches were also used to evaluate the plasticity of the lipidome with the variation of the salinity (5, 20 and 35 ppt of NaCl) and temperature (10, 20, 30 and 40°C). The different combinations of salinity and temperature allowed the production of biomass with different lipid compositions. High salinity decreased the content of GL and PL, and accumulated betaine lipids at 20°C. Higher temperatures reduced the n-3/n-6 ratio affecting nutritional properties. Finnaly, several lipid fractions of C. amblystomatis and N. oceanica enriched in GL, monogalactosyldiacylglycerol and betaine lipids and PL were obtained using solid-phase extraction and tested for anti-inflammatory activity in Raw264.7 macrophages. These lipid fractions showed strong inhibition against lipopolysaccharide (LPS)-induced production of NO and transcription of Nos2, Ptgs2, Tnfa and Il1b. The most active fractions were the betaine lipids and PL-enriched fraction from N. oceanica, and the GL-enriched fraction from C. amblystomatis. Overall, the results obtained within the scope of this thesis allowed us to significantly increase our knowledge of microalgae lipids, contributing to their valorization as ingredients, rich in potent anti-inflammatory compounds, which can be used in heathy and sustainable diets, and with the potential to prevent and resolve chronic inflammation and NCD.

As microalgas são alimentos inovadores, sustentáveis e versáteis, sendo consumidas por humanos há séculos. As microalgas são ricas em nutrientes essenciais e compostos bioativos com relevância na prevenção de doenças não comunicáveis (NCD). Destes compostos destacam-se os lípidos polares, em particular, os esterificados com ácidos gordos polinsaturados (PUFA), que possuem importantes propriedades bioativas, com benefícios descritos para a saúde e potencial terapêutico no tratamento das NCD. No entanto, o conhecimento do lipidoma de microalgas, a caracterização de lípidos bioativos e os mecanismos envolvidos nessas propriedades bioativas são ainda largamente desconhecidos o que limita a exploração das microalgas como fonte de lípidos alimentares ou biofarmacêuticos. Esta tese de dissertação de Doutoramento tem como principais objetivos a identificação do lipidoma de microalgas comercializadas utilizando uma abordagem lipidómica com base na espetrometria de massa, a produção e caracterização de extratos obtidos com tecnologias sustentáveis, compreender a plasticidade do lipidoma de microalgas a diferentes condições de crescimento; e avaliar as propriedades antioxidante e anti-inflamatória de lípidos de microalgas. Para alcançar estes objetivos, foram efetuadas diversas tarefas, incluindo: a identificação dos perfis de ácidos gordos (FA) por espetrometria de massa acoplada a cromatografia gasosa (GC-MS); a determinação dos índices de qualidade lipídica e avaliação da atividade antioxidante de sete microalgas diferentes - Chlorella vulgaris, Chlorococcum amblystomatis, Nannochloropsis oceanica, Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus obliquus, Spirulina sp. e Tetraselmis chui; a primeira identificação profunda das microalgas C. amblystomatis e Tetraselmis striata CTP 4 do filo Chlorophyta por espetrometria de massa acoplada a cromatografia líquida (LC-MS); e a determinação das propriedades anti-inflamatórias dos lípidos das C. amblystomatis e N. oceanica através da incubação destes lípidos com macrófagos Raw264.7 e avaliação do seu impacto em mediadores pro-inflamatórios como a produção de óxido nítrico e a expressão dos genes Nos2, Ptgs2, Tnfa e Il1b. As microalgas estudadas exibiram um perfil de FA específico para cada espécie e com uma composição em n-3 PUFA específica, mas algumas espécies do mesmo filo apresentaram alguma similaridade. As microalgas do filo Chlorophyta apresentavam um alto conteúdo do ácido α-linolénico (ALA), enquanto os filos Ochrophyta e Bacillariophyta apresentavam alto conteúdo em ácido eicosapentaenóico (EPA). A S. obliquus continha o maior conteúdo em n-3 PUFA enquanto a Spirulina sp. não possuia n-3 PUFA. Todas as microalgas apresentaram baixos índices de qualidade lipídica, incluindo índice de aterogenecidade e índice de trombogenecidade, sugerindo propriedades benéficas para a saúde. Os diferentes extratos lipídicos apresentaram atividade antioxidante semelhante, verificando-se uma maior atividade associada aos extratos de S. obliquus e C. vulgaris. A atividade antioxidante apresentou uma correlação positiva com o conteúdo em PUFA. O estudo do lipidoma da C. amblystomatis permitiu a identificação de 350 espécies de lípidos polares distribuídos através de diferentes classes de glicolípidos (GL), betaínas e fosfolípidos (PL), dos quais 157 se encontravam esterificados com n-3 PUFA, como ALA e EPA. Alguns destes compostos foram previamente descritos como possuindo potencial bioativo. O uso de extração assistida com ultrassons (UAE) com etanol (EtOH), um solvente com impacto ambiental reduzido, permitiu obter extratos ricos em lípidos polares passíveis de serem utilizados na indústria alimentar e com rendimentos de extração semelhantes aos de extração convencional com solventes clorados. A análise lipidómica revelou que os extratos obtidos com UAE apresentavam um perfil de lípidos ricos em n-3 PUFA semelhante à extração com solventes clorados. O lipidoma da T. striata CTP4 também foi identificado e verificou-se a presença de 82 PL, 105 GL, 37 betaínas e 82 lípidos neutros. Esta abordagem lipidómica foi também utilizada para avaliar a plasticidade do lipidoma a diferentes combinações de salinidade (5, 20 e 35 ppt de NaCl) e temperatura (10, 20, 30 e 40°C). As diferentes combinações de salinidade e temperatura permitiram a produção de biomassa com composições lipídicas diferentes. A salinidade elevada produziu uma diminuição nos conteúdos de GL e PL, e a acumulação de betaínas a 20°C. Quando de utilizaram temperaturas elevadas, observou-se uma redução no rácio n-3/n-6, afetando as propriedades nutricionais potenciais desta microalga. Finalmente, utilizando processos de extração de fase sólida, foram obtidas várias frações lipídicas das microalgas C. amblystomatis e N. oceanica enriquecidas em 1) GL, 2) monogalactosildiacilglicerol e 3) betaínas e PL. Estas frações foram testadas para avaliar o seu potencial anti-inflamatório em macrófagos Raw264.7. Estas frações lipídicas inibiram a produção de NO induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e transcrição dos genes Nos2, Ptgs2, Tnfa e Il1b. As frações mais ativas foram as frações enriquecidas em betaínas e PL da N. oceanica e em GL da C. amblystomatis. Os resultados obtidos no âmbito desta tese permitiram aumentar significativamente o nosso conhecimento dos lípidos de microalgas, contribuindo para a sua valorização como ingredientes promissores, ricos em compostos anti-inflamatórios, que podem ser utilizados em dietas saudáveis e sustentáveis, com potencial para prevenir e resolver a inflamação crónica e NCD.