Otimização do aproveitamento de material biológico ao longo do fluxo de trabalho em provas forenses de agressão sexual

Abstract

Em casos de agressão sexual, podem ser solicitadas provas forenses e analisadas por pessoal especializado, como é o caso de quem trabalha no Instituto de Ciências Forenses “Luís Concheiro”, da Universidade de Santiago de Compostela. Neste laboratório, as amostras de sémen são analisadas seguindo o fluxo de trabalho que começa com a realização de testes preliminares imunocromatográficos de fluxo lateral, para deteção de sémen; seguindo para extração do ADN presente nas células e quantificação por qPCR (PCR em tempo real) do ADN autossómico e do cromossoma Y extraídos; e finalmente amplificação por PCR (Polimerase Chain Reaction) de STRs (Short Tandem Repeats) e genotipagem por eletroforese capilar das amostras. Os objetivos deste trabalho foram: 1) comparar a persistência do sémen em amostras de recolhas vaginais entre os testes preliminares usados no laboratório, 2) comparar a persistência do sémen entre os dois métodos analisados, avaliando posteriormente a capacidade de extração de ADN para estes métodos, e 3) determinar a sensibilidade do sémen em amostras frescas e congeladas. Dos métodos analisados, pretendeu-se comparar o método usado no laboratório (Método 1), onde se realizam duas extrações distintas de material biológico a partir de uma amostra, com o método proposto (Método 2), em que toda a amostra sofreu extração e foi usada para as análises do fluxo de trabalho. Analisaram-se casos de agressão sexual arquivados, dos anos 2019 a 2022, registando as análises realizadas e os resultados obtidos. Prepararam-se séries de amostras: recolhas vaginais pós-coitais e diluições de sémen, e realizaram-se os testes preliminares SERATEC© PSA Semiquant e RSID™-Sémen, e para RSID™-Sémen, os métodos 1 e 2. Realizou-se extração normal e diferencial com o kit comercial PrepFiler™ Express, no equipamento AutoMate™ Express, e quantificação com o kit comercial Quantifiler™ Trio do material genético. Finalmente, amplificou-se e genotipou-se com os kits comerciais GlobalFiler™ e Yfiler™ Plus, comparando-se posteriormente com os perfis dos dadores genéticos. Nos 44 casos analisados, foram realizados testes para 307 amostras, das quais 3 tiveram resultados diferentes do expectável e com o trabalho prático foi encontrada uma justificação possível, o facto RSID™-Sémen detetar até mais tempo pós-coito. Com os testes preliminares, o método 2 mostrou detetar menor quantidade de sémen que o método 1. Com a quantificação, notou-se grande presença de ADN autossómico na primeira fração, vindo de células epiteliais femininas, e do ADN do cromossoma Y apenas na segunda fração, vindo das células espermáticas. Com a genotipagem não foi possível tirar conclusões concretas, por falta de congruência dos resultados. Para concluir, os resultados obtidos justificam a continuação e aprofundamento destes estudos para otimização do fluxo de trabalho.

In cases of sexual assault, forensic evidence can be requested and analysed by specialised personnel, such as those working at the "Luís Concheiro" Institute of Forensic Sciences from the University of Santiago de Compostela. In this laboratory, semen samples are analysed according to a workflow that starts with preliminary immunochromatographic lateral flow tests, to detect semen; followed by extraction of DNA present in the cells and quantification by qPCR (real-time PCR) of the extracted autosomal and Y chromosome DNA; and finally, PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification of STRs (Short Tandem Repeats) and genotyping by capillary electrophoresis of the samples. The objectives of this work were: 1) to compare semen persistence in vaginal swab samples between the preliminary tests used in the laboratory, 2) to compare semen persistence between the two methods analysed, and subsequently evaluate the DNA extraction capacity for these methods, and 3) to determine the sensitivity of semen in fresh and frozen samples. Of the methods analysed, we aimed to compare the method used in the laboratory (method 1), where two separate extractions of biological material were performed for one sample, with the proposed method (method 2), where the entire sample was extracted and used for all workflow analyses. Sexual assault cases on file from 2019 to 2022 were analysed, recording the analyses performed and the results obtained. Sample series were prepared: post-coital vaginal collections and semen dilutions; and SERATEC© PSA Semiquant and RSID™ -Semen preliminary tests, as well as methods 1 and 2 for RSID™ -Semen, were performed. Normal and differential extraction was performed using the PrepFiler Express™ commercial kit, in the AutoMate™ Express extractor, and quantification with the Quantifiler™ Trio commercial kit of the genetic material. Finally, the genetic material was amplified and genotyped using the GlobalFiler™ and Yfiler™ Plus commercial kits, and then compared with the profiles of the genetic donors. In the 44 cases analysed, tests were conducted for 307 samples, of which 3 had results that were different from expected, and with practical work a possible justification was found, the fact that RSID™-Semen detects even longer post-coitus. With the preliminary tests, method 2 detected less semen than method 1. With the quantification, autosomal DNA was noted in the first fraction, while Y chromosome DNA was only detected in the second fraction. With genotyping, no concrete conclusions could be drawn. To conclude, the results defend the need to further develop these studies for workflow optimisation.