The role of serum amyloid A3 protein in bone loss during Mycobacterium avium infection

Abstract

Mycobacterial infections can lead to the loss of bone mass without direct colonization of the bone. Osteopenia arises from a dysregulation of the bone turnover, due to enhanced bone degradation and/or impaired new bone formation. The indirect bone loss during infection is due to the production of immune mediators by the host upon pathogen invasion. Previous studies using a murine model of M. avium disseminated infection indicated that bone mass was decreased in an IFNγ and TNFα-dependent manner, and that Saa3 was the gene whose expression in the bone increases the most with infection. Therefore, this thesis aims to further understand the molecular mechanisms of bone loss associated to chronic mycobacterial infection and dissect the role of the serum amyloid A3 protein (SAA3) in bone degradation and bone formation. Here, we show that M. avium-infected macrophages produce soluble pro-osteoclastogenic factors (SPOFs) that increase bone resorption by osteoclasts. We identified TNFα as a SPOF produced by infected macrophages and whose production is potentiated by IFNγ. Moreover, we assessed that SAA3 is another SPOF produced by M. avium-infected macrophages in vitro and TNFα enhances Saa3 expression in infected macrophages. Likewise, we determined that in vitro differentiated osteoclasts produce SAA3 upon TNFα stimulation. Furthermore, the SAA protein stimulates osteoclastogenesis, while not enhancing their resorptive activity. However, TNFα addition increases the proportion of trenches. We further found that the conditioned media from infected macrophages had no effect on the mineralization capacity of osteoblasts and that SAA diminished it, indicating that SAA impairs osteoblastic differentiation and activity. Overall, our results highlight a possible molecular mechanism for bone loss during chronic infection, in which IFNγ, TNFα, and SAA3 are the key molecules. M. avium infection leads to the production of IFNγ, which will instruct macrophages to produce SPOFs like TNFα and SAA3. Chronic infection will increase bone destruction, as SAA and TNFα enhance the formation and activity of osteoclasts, respectively. Simultaneously, SAA protein impairs osteoblastic differentiation and activity. Our results emphasize the role of SAA proteins, particularly the SAA3 protein, as key proteins in the bone turnover process during mycobacterial infection.

As infeções micobacterianas podem levar à perda de massa óssea sem que ocorra colonização direta do osso. A osteopenia resultante surge de uma desregulação do processo de remodelação óssea, quer pelo aumento da degradação do osso, quer pela diminuição da sua formação. A perda de massa óssea resultante da infeção é provocada pela produção de mediadores do sistema imune pelo hospedeiro após a entrada do agente patogénico. Estudos prévios utilizando um modelo in vivo de infeção disseminada por M. avium indicaram que a diminuição da massa óssea é dependente de IFNγ e TNFα, e que o Saa3 é o gene cuja expressão mais aumenta com a infeção nos ossos destes animais. Sendo assim, esta tese tem por objetivo aprofundar os mecanismos moleculares de perda de massa óssea associados às infeções micobacterianas e compreender o papel da proteína sérica amiloide A3 (SAA3) na degradação e formação óssea. Aqui mostramos que macrófagos infetados por M. avium produzem fatores solúveis pro-osteoclastogénicos (SPOFs) como o TNFα que aumentam a reabsorção óssea pelos osteoclastos. A produção de TNFα pelos macrófagos infetados por M. avium é estimulada pelo IFNγ. Também demonstrámos que a SAA3 é outro SPOF produzido por macrófagos infetados por M. avium in vitro, e que o TNFα aumenta a expressão de Saa3 em macrófagos infetados. Determinámos também que osteoclastos diferenciados in vitro produzem SAA3 quando estimulados com TNFα. Aferimos que a proteína SAA estimula a osteoclastogénese, ainda que não aumente a atividade de reabsorção destas células. Porém, a adição de TNFα aumenta a proporção de trincheiras. Além disso, aferimos também que o meio condicionado de macrófagos infetados não teve efeito na capacidade de mineralização dos osteoblastos e que a adição de SAA diminuiu-a, o que indica que a SAA prejudica a diferenciação dos osteoblastos e a sua atividade. No geral, os nossos resultados realçam um possível mecanismo molecular para a perda de massa óssea durante uma infeção crónica, em que o IFNγ, TNFα e SAA3 são as moléculas-chave. A infeção por M. avium leva à produção de IFNγ, que irá instruir os macrófagos a produzirem SPOFs como o TNFα e a SAA3. A infeção crónica vai levar à destruição do osso, uma vez que a SAA e o TNFα aumentam a formação e atividade dos osteoclastos respetivamente. Simultaneamente, a proteína SAA dificulta quer a diferenciação quer a atividade dos osteoblastos. Os nossos resultados enfatizam o papel das proteínas SAA, particularmente a SAA3, como proteínas chave na remodelação óssea durante a infeção por micobactérias.