Novel therapeutic strategies for ischemic stroke: high throughput screening using a brain spheroid stroke model

Abstract

Ischemic Stroke is a multifaceted occurrence, caused by the blockage of blood flow/oxygen into the brain, triggering cell damage and neuronal death. Stroke remains one of the major causes of death and adult disability worldwide, whereas acute ischemic stroke (AIS) represents 71% of stroke events. Time is the most important factor for the outcome of these stroke patients: the quicker the restoration of the blood flow, the better the outcomes. However, despite the increase in survival rates, neurological outcomes must be improved, especially in terms of independence/motor function. The combination of reperfusion and brain protective medicine is the future of stroke therapy. Hence, research has been focusing on the study of possible cytoprotective molecules that can reduce brain damage and/or reverse apoptosis in the brain. Despite the huge number of drugs studied, very few reached clinical practice yet. Thus, the establishment of more accurate in vitro preclinical models is essential for the success of future therapies. Brain spheroids, which are a recent development, represent a very valuable asset within this research field. In the present work, we aim to optimize a combination of brain spheroids with oxygen and glucose deprivation (OGD) as an in vitro model for stroke. Through morphological, viability and molecular tests, we show that this model recapitulates the human brain during ischemic stroke. Moreover, we tested three drugs considered protective (BDNF, TTR and MK801) using this model. Then, we established a practical, straightforward method to evaluate the drug effects on the spheroids after OGD, using only morphological parameters and fluorescent probes. Lastly, immunostaining optimization was performed using control and OGD spheroids. Overall, this method could represent an innovative technique for high throughput screening (HTS) assays. The next step would be to apply the model hereby described in the screening of new promising compounds, and understand how different cell populations can be affected; however, further optimizations are still needed. All in all, we contributed with an innovative tool, with which we can screen new compounds or repurpose approved ones, in larger screening assays.

Acidentes Vasculares Cerebrais (AVCs) são ocorrências multifacetadas, causadas pelo bloqueio da corrente sanguínea/oxigénio para o cérebro, instigando dano celular e morte neuronal. Os AVCs continuam a ser uma das principais causas de morte e de incapacidade no mundo. Os AVCs isquémicos representam 71% dos eventos. O tempo é o principal fator determinante do desenlace do evento: quanto mais rapidamente for restaurado o fluxo sanguíneo, melhor o resultado para o paciente. Porém, apesar do aumento nas taxas de sobrevivência, o resultado neurológico deve ser melhorado, especialmente no que toca à independência/função motora. A combinação entre reperfusão e fármacos que protejam o cérebro será o próximo desenvolvimento na terapia dos AVCs. Assim, a investigação tem-se focado no estudo de possíveis moléculas citoprotetoras que reduzam o dano cerebral e/ou revertam a apoptose no cérebro. Apesar do grande número de moléculas estudadas, muito poucas são já utilizadas na medicina. O estabelecimento de modelos in vitro mais precisos é essencial para o sucesso de terapias futuras. Os esferóides cerebrais representam um desenvolvimento recente, constituindo um recurso valioso para esta investigação. Neste trabalho, pretendemos otimizar uma combinação entre esferóides cerebrais e privação de oxigénio e glucose (PGO), como modelo de AVC in vitro. Através de testes morfológicos, de viabilidade e moleculares, demonstrámos que este é um modelo que recapitula o que ocorre no cérebro humano durante o AVC. Para além disso, testámos três moléculas consideradas protectoras (BDNF, TTR e MK801) utilizando este modelo. Depois, estabelecemos um método prático e simples para avaliar o efeito destes fármacos nos esferóides após PGO, utilizando apenas parâmetros morfológicos e sondas fluorescentes. Por último, foi feita uma otimização do processo de imunocoloração, utilizando esferóides de controlo e PGO. Este método poderá ser uma técnica inovadora para rastreio de fármacos em larga escala. No futuro, após otimizações adicionais, seria importante estender a utilização do modelo aqui desenvolvido à testagem de outros compostos promissores, e entender como as diferentes populações celulares são afetadas. Em suma, com este trabalho, contribuímos com uma ferramenta inovadora, com a qual podemos fazer triagens de larga escala de novos compostos, ou repropor alguns já testados.