Understanding bladder pain syndrome: characterization of chronic pelvic pain animal models

Abstract

Bladder Pain Syndrome is a debilitating chronic pain condition that is currently difficult to diagnose and treat due to the lack of consensus on the aetiology, definition, and management. In the past, the Bladder Pain Syndrome was recognized as a bladder-centred disease. However, several evidence have been indicating that this disease might be a systemic syndrome involving centrally mediated mechanisms and that it can manifest itself in different phenotypes. These different phenotypes might explain why the existent treatments are not universally effective. There is no single animal model capable of reproducing all these phenotypes. Thus, a better approach to improve the study of the Bladder Pain Syndrome and find more successful treatments to this disease involves to understand the pathophysiological mechanisms underlying each phenotype by using the animal models that show a phenotype more similar to each subgroup of patients. In this sense, in the current work we performed the cellular and molecular characterization of two brain structures known to be involved in chronic pain development, the insula and the hippocampus, in two systemic models of this disease, the Water Avoidance Stress Model and the Maternal Deprivation Model. In addition, we aimed to understand how the changes in these brain regions might be associated with animals pain behaviour. To establish a rat model of Water Avoidance stress, adult female Wistar rats were daily placed, during 10 consecutive days, for a period of 1 hour, on pedestals in the centre of cages filled with water. To establish the rat model of Maternal Deprivation, female Wistar pups were daily separated from their mother and their littermates for a period of 1 hour, during 14 consecutive days. Changes in microglia cells density, morphology and phagocytic activity were assessed in the granular and dysgranular areas of the insula and on the CA1 region of the hippocampus of the animals by immunofluorescence staining using the markers Iba1 and CD68. Changes in the mRNA expression levels of the markers Iba1, CD68, Olig2, Sst, GFAP, CCR2, c-fos, Pdyn and TNF-α were assessed in animals insula by quantitative real-time PCR using TaqMan probes. Thermal hyperalgesia and mechanical allodynia were also evaluated in the animals, by the Hargreaves test and the Von Frey test, respectively. Animals submitted to Water Avoidance Stress exhibited decreased mRNA expression levels of the markers Pdyn, Olig2 and GFAP and increased mRNA expression levels of CCR2 in the insula. They also exhibited an increased number of microglia cells in regions of the insula in study compared to the sham-sham animals, but these displayed a decreased ramification. As regard to the CA1 region of the hippocampus, these animals exhibited microglia cells with an increased ramification and phagocytic activity. These changes concurred with the development of mechanical allodynia in the animals. Animals submitted to maternal deprivation showed decreased mRNA expression levels of c-fos and a decreased number of microglia cells in the regions of the insula studied. Also, they exhibited microglia cells with an increased phagocytic activity comparatively with the sham-sham animals. Also, microglia cells from these animals displayed a different branch arrangement when compared to the sham-sham microglia cells. As regards to the CA1 region of the hippocampus, animals submitted to maternal deprivation exhibited a decreased number of microglia cells with a decreased territorial volume. Additionally, although these animals did not show microglia cells with a different number of branches, they exhibited a different branch arrangement, in a sense that the brunching points are more proximal to the cells soma. These changes concurred with mechanical allodynia and thermal hyperalgesia. Altogether, our data indicate that the changes induced in the insula and on the hippocampus of the female rats depend on the type of stress induced. More precisely, our results suggest that Water Avoidance Stress induced neuroinflammation and changes in neuronal and glial cells activity in the insula and that these changes might be associated with the mechanical allodynia observed in the animals in the present study and with the transient bladder hyperactivity observed in this model in other studies. The changes induced by this paradigm in microglia status in the hippocampus might also be involved in the development of the mechanical allodynia observed in the animals. However, more studies are required to clarify this hypothesis. As regards to the maternal deprivation model, together, our findings suggest that this stress paradigm seems to induce long last changes in the insula by decreasing the neuronal activity and increasing microglia phagocytic activity and that these changes might be associated with the mechanical allodynia and thermal hyperalgesia observed in the animals. If the changes induced by this paradigm in microglia in the CA1 region of the hippocampus are also associated with animals mechanical allodynia and thermal hyperalgesia, it is not yet clear. Further studies are needed to better study this correlation.

A síndrome da bexiga dolorosa é uma condição de dor crónica debilitante que atualmente é difícil de diagnosticar e tratar devido à falta de consenso sobre a sua etiologia, definição e gestão. No passado, a síndrome da bexiga dolorosa era reconhecida como uma doença centrada na bexiga. No entanto, várias evidências têm vindo a indicar que esta doença pode ser uma síndrome sistémica que envolve mecanismos mediados centralmente e que se pode manifestar em diferentes fenótipos. Estes diferentes fenótipos podem ser a razão pela qual os tratamentos existentes não são universalmente eficazes. Não existe um único modelo animal capaz de reproduzir todos estes fenótipos. Como tal, a melhor abordagem para melhorar o estudo da síndrome da bexiga dolorosa e encontrar tratamentos mais eficazes para esta doença envolve entender os mecanismos fisiopatológicos subjacentes a cada fenótipo, usando para isso os modelos animais que mostram um fenótipo mais semelhante a cada subgrupo de pacientes. Neste sentido, no presente trabalho realizamos a caracterização celular e molecular de duas estruturas cerebrais que se sabe estarem envolvidas no desenvolvimento de dor crónica, a ínsula e o hipocampo, em dois modelos sistémicos desta doença, o modelo de stress por evitação de água e o modelo de deprivação maternal. Para além disso, pretendemos entender também como é que as alterações moleculares e celulares nestas regiões cerebrais podem estar associadas ao comportamento de dor nos animais. Para induzir o modelo de stress por evitação de água, ratos fêmea Wistar adultos foram colocados diariamente, durante 10 dias consecutivos, por um período de 1 hora, em pedestais no centro de gaiolas preenchidas com água. Para induzir o modelo de separação maternal, após o nascimento, ratos fêmeas Wistar foram separados diariamente da progenitora e da ninhada por um período de 1 hora, durante 14 dias consecutivos. Alterações na densidade, morfologia e atividade fagocítica das células da microglia foram avaliadas nas regiões granular e desgranular da ínsula, e na região CA1 do hipocampo destes animais por imunofluorescência usando os marcadores Iba1 e CD68. Alterações na expressão de mRNA dos marcadores Iba1, CD68, Olig2, Sst, GFAP, CCR2, c-fos, Pdyn e TNF-α foram avaliadas na ínsula dos animais por PCR quantitativo em tempo real usando sondas TaqMan. A hiperalgesia térmica e alodinia mecânica também foram avaliadas nos animais, através do teste de Hargreaves e do teste de Von Frey, respetivamente. Observou-se que os animais submetidos a stress por evitação de água exibiram uma diminuição dos níveis de expressão de mRNA dos marcadores Pdyn, Olig2 e GFAP e um aumento dos níveis de expressão de mRNA de CCR2 na ínsula. Para além disso, estes animais também exibiram um maior número de células da microglia nas regiões da ínsula estudadas em comparação com os animais sham-sham, porém, com uma menor ramificação. Em relação à região CA1 do hipocampo, estes animais exibiram células da microglia com uma maior ramificação e uma maior atividade fagocítica. Estas alterações coincidiram com o desenvolvimento de alodinia mecânica nestes animais. Quanto aos animais submetidos ao paradigma de separação maternal, estes mostraram uma diminuição nos níveis de expressão de mRNA de c-fos na ínsula e uma diminuição do número de células da microglia nas regiões da ínsula em estudo. Além disso, eles exibiram células da microglia com uma maior atividade fagocítica comparativamente aos animais sham-sham nesta estrutura cerebral. Para além disso, as suas células da microglia apresentaram um arranjo das suas ramificações diferente das células da microglia dos animais sham-sham. No que diz respeito à região CA1 do hipocampo, os animais submetidos a separação maternal exibiram um número de células da microglia menor e com um menor volume territorial. Adicionalmente, apesar destes animais não terem apresentado células da microglia com um número diferente de ramificações, estas exibiram um arranjo diferente das suas ramificações, no sentido em que estas passaram a estar mais próximas do seu soma. Estas alterações coincidiram com o desenvolvimento de alodinia mecânica e hiperalgesia térmica nos animais. Em conjunto, os nossos dados indicam que as alterações induzidas na ínsula e no hipocampo de ratos fêmeas Wistar adultos dependem do tipo de stress induzido. Mais precisamente, os nossos resultados sugerem que a indução de stress por evitação de água induziu neuroinflamação e alterações na atividade das células neuronais e gliais na ínsula e que essas alterações podem estar associadas à alodinia mecânica observada nos animais no presente estudo, e à hiperatividade transitória da bexiga observada neste modelo em outros estudos. As mudanças induzidas por este modelo no estado da microglia no hipocampo também podem estar envolvidas no desenvolvimento da alodinia mecânica observada nos animais, porém, mais estudos são necessários para esclarecer esta hipótese. Em relação ao modelo de separação maternal, em conjunto, os nossos dados sugerem que este paradigma de stress parece induzir mudanças duradouras na ínsula ao causar a diminuição da atividade neuronal e o aumento da atividade fagocítica das células da microglia, e que estas mudanças podem estar associadas à alodinia mecânica e hiperalgesia térmica observadas nos animais. Ainda não é claro se as alterações induzidas por este paradigma nas células da microglia na região CA1 do hipocampo também estarão associadas à alodinia mecânica e hiperalgesia térmica observadas nos animais. Mais estudos são necessários no futuro para estudar essa correlação.