Analysis of RiPPs biosynthetic clusters of Haloferax mediterranei and Pedobacter lusitanus

Abstract

Secondary metabolites (SMs) are a diverse group of compounds. The SMs of peptide origin that are synthesized by the ribosome and undergo several post-translational modifications are called RiPPs. Haloferax mediterranei ATCC 33500, a strain of haloarchaea, and Pedobacter lusitanus NL19, a bacterial strain, have biosynthetic genes (clusters) that encode the production of a subtype of RiPPs named lanthipeptides. Additionally, the genome of H. mediterranei also possesses genes involved in the biosynthesis of another group of RiPPs: the haloazolisins. The objectives of this work focused on the analysis of biosynthetic clusters in the two strains aforementioned. As such, for H. mediterranei, specific objectives were to evaluate: i) whether the RiPPs clusters are cryptic and ii) the biomolecular profile of the strain in the absence of the RiPPs´ core enzymes (HaloMs and YcaO). For this, RT-qPCR and FTIR techniques were employed, respectively. For P. lusitanus, the ped15 lanthipeptide gene cluster was selected and the objectives were: i) to evaluate the transcription of pedA15 operon in different culture media, to identify one with active transcription and ii) to initiate the construction of a biosensor that enables the rapid transcriptional analysis of these genes. For this, we used RT-qPCR and cloning techniques, respectively. The results showed that for H. mediterranei all the genes analyzed are transcribed under the conditions evaluated, with a tendency of the number of copies to decrease over time. FTIR analysis revealed that the absence of the enzymes HaloMs or YcaO implied a change in the levels of amides and lipids. Regarding P. lusitanus, SPA medium seems to be the most promising for obtaining a higher number of transcripts of the pedA15 operon. However, a repressor was identified in the ped15 cluster, which is 10X more transcribed than the pedA15 operon. This protein should be taken into consideration for the development of the future biosensor, which was initiated in this work with the cloning of promoter regions upstream of the luciferase operon genes.

Os metabolitos secundários (SMs) são um grupo diverso de compostos. Entre estes incluem-se os de origem peptídica, que são sintetizados pelo ribossoma, sofrem diversas modificações pós-traducionais e que são designados RiPPs. Haloferax mediterranei ATCC 33500, uma estirpe de haloarchaea, e Pedobacter lusitanus NL19, uma estirpe bacteriana, possuem agrupamentos de genes biossintéticos (clusters) que codificam para a produção de um subtipo de RiPPs, que se designam lantipéptidos. Adicionalmente, o genoma de H. mediterranei possui genes envolvidos na biossíntese de outro grupo de RiPPs: as haloazolisinas. Os objetivos deste trabalho focaram-se na análise de clusters biossintéticos de RiPPs nas duas estirpes atrás referidas. Assim, para H. mediterranei, foi avaliado: i) se esses clusters são crípticos e ii) o perfil biomolecular da estirpe na ausência das enzimas centrais para a biossíntese de RiPPs (HaloMs e YcaO). Para tal, recorreu-se às técnicas de RT-qPCR e FTIR, respetivamente. Para P. lusitanus, foi selecionado o cluster de lantipéptidos ped15 e os objetivos específicos foram: i) avaliar a transcrição do operão dos genes estruturais pedA15 em diferentes meios de cultura, de forma a identificar um meio com transcrição ativa e ii) iniciar a construção de um biossensor que possibilite a análise transcricional destes genes, de uma forma rápida. Para tal, recorremos às técnicas de RT-qPCR e clonagem, respetivamente. Os resultados mostraram que todos os genes analisados de H. mediterranei são transcritos nas condições avaliadas, com uma tendência de diminuição no número de cópias ao longo do tempo. A análise FTIR revelou que a ausência das enzimas HaloMs ou YcaO implicou numa alteração nos níveis de amidas e lípidos. Relativamente a P. lusitanus, o meio SPA mostrou ser o meio mais promissor para obter um maior número de transcritos do operão pedA15. Contudo, foi identificado um repressor no cluster ped15, que é 10X mais transcrito do que o operão pedA15. Esta proteína deve ser considerada aquando do desenvolvimento futuro do biossensor, que foi iniciado neste trabalho e que incluiu a clonagem de regiões promotoras a montante dos genes do operão da luciferase.